Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Фермент органофосфатгидролаза 10
1.1.1. Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента 11
1.1.2. Пространственная структура ОРН 18
1.2. Создание гибридных белков 21
1.2.1. Гибридные партнеры, увеличивающие выход растворимой формы целевого белка в клетках 21 "
1.2.2. Флуоресцентные белки 22
1.2.2.1. Зеленый флуоресцентный белок 23
1.2.2.2. рН-чувствительные генетически модифицированные аналоги GFP 25
1.2.3. ОРН в составе гибридных белков 28
1.3. Рефолдинг белков из телец включения 32
1.3.1. Общие принципы проведения рефолдинга 34
1.3.2. Рефолдинг полигистидинсодержащих белков 35
1.4. Применение биотехнологических приемов усовершенствования культивирования клеток Е. соїі для увеличения выхода растворимой формы рекомбинантных белков 36
1.4.1. Культивирование микроорганизмов в периодическом режиме 36
1.4.2. Культивирование микроорганизмов в полупериодическом режиме 39
1.4.3. Аэрация среды, использование перфторуглеродных соединений для увеличения растворимости кислорода в среде культивирования 43
1.4.4. Экспрессия генно-инженерных конструкций в рекомбинантных клетках микроорганизмов 46
1.5. Применение растворимой формы фермента Hise-OPH 49
1.5.1. Применение ОРН в процессе обезвреживания реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения ФОВ 49
1.5.2. Фильтрующесорбирующие материалы для средств индивидуальной защиты от воздействия ФОС 51
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 56
2.1. Материалы и приборы 56
2.1.1. Реактивы 56
2.1.2. Ферменты 57
2.1.3. Бактериальные штаммы 57
2.1.4. Питательные среды 57
2.1.5. Составы растворов 58
2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды 59
2.1.7. Приборы 59
2.2. Методы 60
2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН 60
2.2.2. Определение рН оптимума действия фермента 60
2.2.3. Исследование термостабильности 60
2.2.4. Приготовление компетентных клеток Е. coli 61
2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli 61
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 61
2.2.7. Рестрикция ДНК и вьщеления фрагментов электрофорезом в агарозном геле 62
2.2.8. Цитирование фрагментов ДНК 62
2.2.9. Конструирование плазмид pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH 63
2.2.10. Определение уровня экспрессии генно-инженерных конструкций pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH и органофосфатгидролазной активности гибридных белков. Изучение кинетики роста клеток Е. coli DH5ct 64
2.2.11. Определение растворимости белка 64
2.2.12. Выделение и очистка полигистидинсодержащих белков с использованием металл-хелатирующих носителей 65
2.2.13. Подготовкакрио-ПААГ носителей 66
2.2.14. Очистка белка His6-deGFP4-(AS)5-OPH 66
2.2.15. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле (ДСН-
электрофорез) 67
2.2.16. Исследование флуоресцентных свойств гибридных белков 68
2.2.17. Компьютерное моделирование 68
2.2.18. Наработка препарата фермента Hisg-OPH для его применения в экспериментах прикладного характера 69
2.2.19. Приготовление фильтрующесорбирующего самодегазирующегося материала 70
2.2.20. Дезактивация РМ, полученных в результате химического гидролиза вещества типа Vx с применением рецептуры РД-ГД с использованием препарата фермента Hise-OPH 71
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 72
3.1. Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН 72
3.1.1. Выбор межмолекулярных спейсеров 72
3.1.2. Создание генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH 73
3.1.3. Экспрессия полученных генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH 75
3.1.4. Выделение и очистка новых гибридных белков 84
3.1.5. Физико-химические и каталитические характеристики генетически- модифицированных аналогов ОРН 88
3.1.6. Исследования структуры ОРН и полученных гибридных белков методами молекулярного моделирования 89
3.1.6.1. Моделирование структуры димера ОРН 89
3.1.6.2. Моделирование структуры мономера ОРН 95
3.1.7. Исследование термостабильности белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH 100
3.1.8. Исследование флуоресцентных свойств полученных гибридных белков 103
3.2. Рефолдинг гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы 109
3.2.1. Зависимость эффективности солюбилизации ТВ от условий проведения
процесса ПО
3.2.2. Проведение рефолдинга Hise-OPH на металл-хелатирующем носителе 112
3.2.3. Активация фермента после рефолдинга 114
3.3. Оптимизация условий культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4],
трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, для увеличения
выхода растворимой формы фермента Hise-OPH 116
3.3.1. Влияние времени введения индуктора в среду культивирования клеток Я coli
SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, на их удельную органофосфатгидролазную активность 116
3.3.2. Влияние температуры культивирования на выход удельной
органофосфатгидролазной активности в клетках Е. coli SG13009[pREP4],
трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-His6-OPH 118
3.3.3. Культивирование клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-ffise-OPH, в периодическом режиме с внесением подпиток 121
3.3.4. Влияние перфторуглеводородов на выход активной биомассы клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-His6-OPH 124
3.4. Применение ферментного препарата 125
3.4.1. Исследование процесса разрушения клеток Е. coli SG13009[pREP4] -продуцентов His6-OPH ультразвуком 125
3.4.2. Длительное хранение ферментного препарата Hise-OPH в различных условиях. 127
3.4.3. Фильтрующесорбирующий самодегазирующийся материал, содержащий Hise-OPH, для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС 130
3.4.3.1. Разработка самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС 130
3.4.3.2. Испытание самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС 133
3.4.4. Детоксикация реакционных масс, полученных в результате химического
гидролиза ФОВ 135
ВЫВОДЫ 141
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
