Введение
2 Трансмембранный транспорт белков у бактерий 13
2.1 Истинная секреция у грамотрицательных бактерий 14
2.2 Sec-система трансмембранной транслокации белков у бактерий 19
2.2.1 Адресация синтезируемых полипептидов в транслоказу 20
2.2.1.1 Структура сигнальной последовательности субстратов Sec-транслоказы 21
2.2.1.2 Адресация при участии SRP 22
2.2.1.3 Адресация при участии шаперона SecB 26
2.2.1.4 Взаимоотношение SRP- и SecB/SecA-зависимых способов адресации 29
2.2.2 Структура и функции Sec-транслоказы 30
2.2.2.1 Стехиометрия компонентов транслоказы 31
2.2.2.2 SecA—молекулярный мотор транслоказы 31
2.2.2.3 Трансмембранный комплекс SecYEG — кор транслоказы 33
2.2.2.4 Роль Sec-транслоказы в биогенезе мембранных белков 39
2.2.2.5 Сигнальные пептидазы первого типа (SPasel) 40
2.2.2.6 Общая схема функционирования Sec-системы транслокации 41
2.2.3 Образование транслоцированными полипептидами нативной конформациив периплазме 43
2.3 ТАТ-система трансмембранной транслокации белков у бактерий 46
2.3.1 Сигнальные пептиды субстратов ТАТ-системы 47
2.3.2 Структурные компоненты ТАТ-системы 49
2.3.3 Особенности функционирования ТАТ-системы транслокации 50
2.4 Использование трансмембранного транспорта при получении рекомбинантных белков 50
3 Энтеротоксины Staphylococcus aureus 54
3.1 Структура стафилококковых энтеротоксинов 55
3.1.1 Пространственная структура 56
3.1.2 Взаимодействие SE с молекулами МНС II 58
3.1.3 Связывание с TCR 60
3.2 Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе 61
3.2.1 Стафилококковые пищевые отравления (SFP) 61
3.2.2 Синдром токсического шока (TSS) 62
3.3 Медицинское значение энтеротоксинов S.aureus 63
3.3.1 Усиление специфичного иммунного ответа 64
3.3.2 Терапия опухолей . 65
3.3.3 Создание вакцин против стафилококковых энтеротоксинов 67
3.3.4 Перспективы медицинского применения стафилококковых энтеротоксинов 68
4 Материалы и методы 70
4.1 Материалы 70
4.1.1 Реактивы 70
4.1.2 Ферменты 70
4.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды 70
4.1.4 Микробиологические среды 72
4.1.5 Олигонуклеотиды 72
4.2 Методы 72
4.2.1 Полимеразная цепная реакция 72
4.2.2 Выделение хромосомной ДНК S.aureus 73
4.2.3 Операции с ДНК 73
4.2.4 Электрофоретическое разделение белков 74
4.2.5 Иммуноблот 74
4.2.6 Фракционирование клеток E.coli 75
4.2.7 Очистка рекомбинантного SEB с помощью ионообменной хроматографии 76
4.2.8 Очистка рекомбинантных SEA и SEB с помощью аффинной хроматографии 76
5 Результаты и обсуждение 78
5.1 Клонирование генов, кодирующих SEA и SEB. Изучение их экспрессии в E.coli 78
5.1.1 Получение плазмид для экспрессии SEA и SEB в E.coli 78
5.1.2 Исследование экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в клетках E.coli 84
5.2 Исследование влияния на эффективность трансмембранной транслокации энтеротоксина А первичной структуры его сигнального пептида 87
5.2.1 Конструирование форм энтеротоксина А с измененным сигнальным пептидом и исследование накопления рекомбинантных белков в клетках E.coli 87
5.2.2 Вероятный механизм влияния исследованных вариантов аминокислотных замен в сигнальном пептиде SEA на его функцию 94
5.3 Очистка рекомбинантных SEB и SEA 97
5.3.1 Очистка SEB путем ионообменной хроматографии 97
5.3.2 Биологическое тестирование очищенного препарата SEB 99
5.3.3.Очистка SEA и SEB путем аффинной хроматографии 101
5.3.3.1 Получение форм SEA и SEB, несущих С-концевой гексагистидиновый мотив 101
5.3.3.2 Проведение аффинной хроматографии 102
5.4 Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков в периплазматическое пространство E.coli на модели энтеротоксинов из S.aureus 104
5.4.1 Клонирование гена, кодирующего ТогА и исследование его внутриклеточной локализации при гиперэкспрессии в E.coli 107
5.4.2 Конструирование плазмид для исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков 109
5.4.3 Исследование накопления гибридных белков в клетках E.coli 114
5.4.4 Возможные механизмы взаимного влияния сигнального пептида и
зрелой части белка на эффективность процесса транслокации 117
6 Выводы 121
7 Список литературных источников
