Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Типы вирусных векторов для экспрессии пептидов и полипептидов в 8
растениях
1.2. Системы презентации эпитопов 9
1.2.1. Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов 9
1.2.2.Системы презентации эпитопов на основе сферических, вирусов 16
1.3 Системы экспрессии полипептидов 22
1.3.1.Вектора, сконструированные по принципу «замена гена» 22
1.3.2.Вектора, сконструированные по принципу «дополнительный ген» 23
1.3.2.1 .Системы экспрессии полипептидов на основе палочковидных вирусов 23
1.3.2.2.Системы экспрессии полипептидов на основе сферических вирусов 31
1.4. Получение вирусоподобных частиц (ВПЧ) в растениях с помощью
вирусных векторов 35
1.5. Стратегии «full virus» и «deconstructed virus» 43
1.6. Векторная система на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 49
1.7. Системы презентации внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А 51
1.8. Нуклеокапсид вируса гепатита В (HBcAg) человека как система презентации эпитопов и полипептидов 56
1.9. Вирусы растений и нанотехнологии 59
1.10 Заключение 62
Глава 2. Материалы и методы 64
2.1. Растения и бактериальные штаммы 64
2.2. Животные 64
2.3. Штамм вируса гриппа 64
2.4. Питательные среды и антибиотики 64
2.5. Ферменты и коммерческие наборы 65
2.6. Реактивы и буфера 65
2.7. Синтетические олигонуклеотиды 65
2.8. Конструирование векторов экспрессии 66
2.9. Секвенирование ДНК 66
2.10. Приготовление компетентных wiQTOKA.tumefaciens для электропорации 66
2.11. Трансформация A. tumefaci$ns и агроинфильтрация растений N. benthamiana и V.unguiculata 66
2.12. Приготовление глицеринового стока культур A.tumefaciens 67
2.13. Приготовление грубого экстракта из листьев V.unguiculata для заражения здоровых растений 67
2.14. Выделение вирусных частиц CPMV 68
2.15. Выделение РНК из вирусных частиц CPMV для ОТ-ПЦР анализа 68
2.16. Частичная очистка ВПЧ HBcAg 69
2.17. Вестерн-блот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях N. bentham іana и V.unguiculata 69
2.18. Получение очищенных препаратов ВПЧ HBcAg 70
2.19. Иммуно-сорбентная электронная микроскопия (ISEM) 70
2.20. Трансмиссивная электронная микроскопия (ТЕМ) 70
2.21. Иммунологическое мечение золотом 71
2.22. Исследование иммуногенпых и протективных свойств химерных вирусных частиц CPMV/M2e 71
2.22.1.Способ введения препарата, получение эмульсии, дозы и схема 71
иммунизации
2.22.2.Метод анализа специфических антител 72
2.22.3.Электронная микроскопия 72
2.22.4.Масс-спектрометрия 73
2.22.5.Статистический анализ 73
Глава 3. Результаты и обсуждение 74
3.1. Получение ВПЧ HBcAg в растениях с помощью векторов на основе Х-ВК и полноразмерной РНК-2 CPMV 74
3.1.1.Конструирование векторов экспрессии HBcAg на основе Х-ВК и CPMV 74
3.1.2. Заражение растений N.benthamiana и V.unguiculata и характер развития симптомов вирусной инфекции 76
3.1.3.Исследование экспрессии белка нуклеокапсида HBV в растениях 78
3.1 ^.Идентификация ВПЧ HBcAg методом ISEM 80
3.2. Получение ВПЧ HBcAg с помощью векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 83
3.2.1.А.Конструирование вектора экспрессии HBcAg на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 84
3.2.1.Б. Конструирование вектора экспрессии HBcAg/M2e на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 84
3.2.2.Агроинфильтрация растений TV.benthamiana векторными конструкциями pBinP/Acore и pBinP/AcoreM2e и анализ экспрессии вариантов HBcAg 85
3.2.3.Электронно-микроскопическое исследование препаратов ВПЧ HBcAg 87
3.2.4.Исследование свойств ВПЧ HBcAg методом иммунологического мечения золотом 90
Система презентации внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А (М2е-эпитопа) человека и птиц на основе CPMV 89
3.3.1.Конструирование векторов экспрессии внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе CPMV 90
3.3.2.3аражение растений V. unguiculata и характер развития вирусной инфекции 92
З.З.З.Анализ генетической стабильности рекомбинантных вирусов 93
З.ЗАВыделение и анализ рекомбинантных вирусных частиц 96
3.3.5.Иммунизацияия мышей химерными вирусными частицами CPMV/M2eH и CPMV/M2eA 100
З.З.б.Изучение протективного действия препарата CPMV/M2eH на модели летальной гриппозной инфекции 101
Выводы 104
Список литературы
