Введение
1 Применение обратной генетики в изучении РНКсодержащих вирусов 11
1. Создание полноценных инфекционных геномов РНКсодержащих вирусов - 11
2. Создание дефектных мини-геномов РНК-сод ержащих вирусов 18
2 Респираторно-синцитиальный вирус человека (PC вирус) 22
1. Биологическая характеристика вируса и структурнофункциональная характеристика вирусного генома - 22
2. Применение методов обратной генетики в отношении PCвирусов для изучения фундаментальных аспектов вирусного морфогенеза 35
3. Применение методов обратной генетики в отношении PC вирусов для решения задач специфической профилактики респираторных заболеваний 44
3 Вирус классической чумы свиней (КЧС) 54
1. Биологическая характеристика вируса и структурно функциональная характеристика вирусного генома 55
1.2. Локализация на геноме вируса КЧС участков, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты 60
1.3. Исследования, направленные на изучение вакцинного штамма КС и разработку на его основе средств дифференциальной диагностики и специфической профилактики КЧС 62
1.3.3.1. Анализ генома штамма КС, филогенетический анализ и разработка теста для идентификации вакцинного штамма методом ПЦР и рестриктного анализа 62
1.3.3.2. Получение рекомбинантного поверхностного гликопротеина Е2 из вакциного штамма КС, субъединичное вакцинирование и разработка иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу КЧС 70
1.3.4. Применение методов обратной генетики для изучения вируса КЧС 76
1.4. Заключение по обзору литературы 78
1.5. Цели и задачи исследования 80
2.1. Материалы и методы исследований 101
2.2. Результаты исследований 111
2.2.1. Выявление молекулярных детерминант вирулентности в геноме респираторно-синцинтиального вируса человека методом создания и исследования инфекционных дефектных вирусов 111
2.2.1.1. Определение и анализ первичной структуры генома штамма 2В PC-вируса человека 111
2.2.1.2. Определение и анализ первичной структуры геномов аттенуированного штамма PC-вируса 2B33F и ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята 2B33F(TS+). Выявление потенциальных детерминант вирулентности на основе сравнительного анализа полных последовательностей геномов вирулентного и аттенуированого штамов РС-вируса человека 127
2.2.1.3. Конструирование дефектных вирусных мини-геномов, содежащих репортерый ген хлорамфениколацетилтрансферазы и регуляторные области из вирулентного и аттенуированого штаммов PC-вируса человека 131
2.2.1.4. Исследование инфекционности, репликации и транскрипции дефектных вирусных частиц при одновременном заражении различными штаммами вируса-помощника 137
2.2.1.5 Исследование инфекционности, параметров репликации и транскрипции дефектных вирусных частиц при одновременной трансфекции рекомбинантными комплементирующими плазмидами 144
2.2.1.6 Анализ транскрипции и репликации мини-геномов PC вируса в опытах по РНК-гибридизации и защите радиоактивно меченых гибридов от действия РНКаз 149
2.2.2. Получение маркированного вакцинного штамма вируса классической чумы свиней на основе полноразмерной инфекционной копии генома данного вируса 154
2.2.2.1. Анализ генов вирусных оболочечных гликопротеинов 155
2.2.2.2. Разработка стратегии и сборка полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней в E.coli под контролем промотора фага Т7, синтез in vitro геномной РНК данного штамма 168
3. Получение инфекционного вируса классической чумы свиней на основе его рекомбинантного генома и проверка его ростовых, антигенных, иммуногенных характеристик, выявление молекулярных маркеров 171
4. Внесение антигенных маркеров в рекомбининтный вирус КЧС: Получение маркированного вакцинного штамма путем замены гена Е2 в инфекционном геноме вируса КЧС (штамм КС) на ген Е2 вируса диареи крупного рогатого скота (цитопатогенный штамм NADL). 177
Респираторно-синцитиальный вирус 186
Вирус классической чумы свиней 204
Выводы 214
Список литературы 217
Приложения 246
