Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1 Основные сведения о лицензированных сибиреязвенных вакцинах и экспериментальных препаратах, допущенных до клинических испытаний
1.2 Адъюванты как иммуностимулирующие компоненты вакцин -классификация, основные свойства, механизм действия и взаимодействие со структурами врожденного иммунитета 25
1.3 Методические подходы к стабилизации вакцин, использование консервантов 38
Собственные исследования 47
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Материалы 47
2.1.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе 47
2.1.2 Питательные среды и реактивы 47
2.1.3 Лабораторные животные 48
2.2 Микробиологические методы исследования 48
2.2.1 Получение посевной культуры рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo- 48
2.2.1.1 Получение бактериальной культуры I пассажа 49
2.2.1.2 Получение бактериальной культуры II пассажа
2.2.2 Культивирование рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo - 49
2.2.3 Контроль чистоты посевной культуры штамма-продуцента B. аnthracis 50 2.2.4 Отделение клеточной биомассы и стерилизация куль-турального фильтрата или супернатанта 50
2.2.5 Подготовка иммунизирующего и тест-заражающего штаммов B. anthracis 51
2.2.6 Определение показателей роста микробных клеток 51
2.2.7 Контроль специфической стерильности препаратов 52
2.3 Биохимические и биофизические методы исследования 52
2.3.1 Выделение и хроматографическая очистка протектив ного антигена из культурального фильтрата рекомби нантного штамма-продуцента B. anthracis 52
55TПА-1Spo
2.3.2 Выделение и очистка белка S-слоя ЕА1 из клеточных стенок рекомбинантного штамма-продуцента B. anthracis 55TПА-1Spo- 53
2.3.3 Белковый электрофорез 55
2.3.4 Определение концентрации белковых препаратов 55
2.3.5 Определение рН растворенного препарата прототипа вакцины 55
2.3.6 Атомно-силовая микроскопия 55
2.4 Иммунохимические методы исследования 56
2.4.1 Определение титров антител в сыворотках иммунизированных животных с использованием твердофазного иммуноферментного анализа 56
2.4.2 Иммуноблот 56
2.4.3 Определение уровня продукции протективного антигена рекомбинантным штаммом 56
2.5 Иммунологические методы исследования 56
2.5.1 Иммунизация лабораторных животных 56
2.5.2 Определение значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных животных 57
2.5.3 Определение ЛД50 тест-заражающего штамма для иммунизированных линейных мышей и морских свинок, индексов иммунитета антигенных препаратов 57
2.5.4 Выделение лимфоцитов тимуса и селезенки 58
2.6 Методы определения потенциальной токсичности биопрепаратов 58
2.6.1 Определение аномальной токсичности биопрепаратов
в экспериментах in vivo 58
2.6.2 Морфологические исследования 58
2.6.3 Гистологические исследования 59
2.7 Молекулярно-генетические методы исследования 59
2.7.1 Выделение РНК из лимфоцитов тимуса и селезенки и обратная транскрипция
2.7.2 Проведение полимеразной цепной реакции 60
2.8 Биотехнологические методы 60
2.8.1 Получение лиофилизата прототипа вакцины 60
2.8.2 Синтез и очистка CpG-ОДН 61
2.8.3 Определение потери массы при высушивании 62
2.9 Статистические методы 62
Глава 3. Определение возможности использования штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- в качестве единого источника иммуногеных антигенов сибиреязвенного микроба – протективного антигена и белка S-слоя EA1 63
Глава 4. Определение способности адъювантов: гидроокиси алюминия, монофосфорилированного липида А и CpG-ОДН повышать иммуноло гическую эффективность сибиреязвенных антигенов, выделенных из рекомбинантного штамма-продуцента 71
4.1 Влияние исследуемых адъювантов на экспрессию толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета 72
4.2 Иммунологическая эффективность сочетания рекомбинантного протективного антигена с различными вариантами синтезированных CpG-ОДН 74
4.3 Сравнение эффективности препаратов, включающих рекомби нантный протективный антиген и один из адъювантов: гидро
окисью алюминия, монофосфорилированным липидом А и CpG-ОДН 77
Глава 5. Изучение влияния полученных из рекомбинантного штамма B. anthracis 55TПА-1Spo- антигенов и их сочетания с адъювантами на органы и ткани иммунизированных животных 83
5.1 Морфометрическое и гистологическое исследование органов и тканей лабораторных животных, иммунизированных протек-тивным антигеном 84
5.2 Морфометрическое и гистологическое исследование органов и тканей лабораторных животных, иммунизированных рекомби-нантным протективным антигеном в сочетании с белком ЕА1 90
5.3 Изучение влияния адъюванта CpG 2006 и его комбинации с альгидрогелем на органы и ткани иммунизированных лабораторных животных 94
Глава 6. Получение прототипа вакцины сибиреязвенной химической, соответствующего требованиям к иммунобиологическим препаратам 100
6.1 Стабилизация белковых молекул в составе прототипа вакцины сибиреязвенной химической 100
6.2 Технологическая схема получения прототипа вакцины сибиреязвенной химической и определение его соответствия требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам 108
6.3 Перспективы дальнейшего изучения прототипа вакцины сибиреязвенной химической 116
Заключение 123
Выводы 135
Список принятых обозначений и сокращений 137
Список использованной литературы
