Введение
ГЛАВА 1. Активные формы кислорода и клеточные тиолы как факторы, определяющие редокс-статус клеток 14
1.1 Активные формы кислорода 14
1.2 Редокс-активные тиолы
1.2.1 Цистеин 15
1.2.2 Глутатион
1.2.2.1 Свойства и синтез глутатиона 17
1.2.2.2 Восстановление глутатиона (глутатионредуктаза ) 20
1.2.2.3 Турновер глутатиона (-глутамилтранспептидаза и -глутамильный цикл) 21
1.2.2.4 Транспорт глутатиона 23
1.2.2.5 Трансмембранная циркуляция глутатиона 24
1.3 Тиол-зависимые редокс-системы клетки 25
1.3.1 Глутаредоксины и тиоредоксины 25
1.3.2 Периплазматические редокс-системы 28
1.4 Eh в бактериальных культурах и низкомолекулярные тиолы 29
ГЛАВА 2. Роль редокс-регуляции при адаптации e. coli к стрессам 31
2.1 Окислительный стресс 31
2.1.1 Пероксидный стресс 31
2.1.2 Супероксидный стресс
2.2 ArcAB и FNR системы 34
2.3 Общий стрессовый ответ и строгий ответ 36
2.4 Другие примеры участия тиолов в редокс-регуляции 39
2.5 Роль GSH в регуляции транспорта К+ 40
2.6 Транспорт фосфата 44
Экспериментальная часть 48
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 48
3.1 Объекты исследования 48
3.2 Питательные среды и условия культивирования 49
3.3 Определение удельной скорости роста 50
3.4 Колониеобразующая способность 50
3.5 Определение живых и мертвых клеток (live-dead test) 51
3.6 Определение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) и pH в среде культивирования 51
3.7 Измерение парциального давления кислорода 52
3.8 Выявление изменений мембранного потенциала 52
3.9 Скорость продукции супероксида
3.10 Определение концентрации перекиси водорода в среде и в клетке 54
3.11 Определение концентрации глутатиона 54
3.12 Определение концентрации внутриклеточного калия 56
3.13 Определение -галактозидазной активности 56
3.14 Определение концентрации цистеина 57
3.15 Статистическая обработка полученных результатов 58
3.16 Материалы 58
ГЛАВА 4. Трансмембранная циркуляция глутатиона при изменении параметров среды в периодических культурах escherichia coli 59
4.1 Изменение удельной скорости роста у различных штаммов E. coli при переходе к микроаэробным условиям 59
4.2 Изучение экспрессии rpoS::lacZ и sodA::lacZ как маркеров индукции RpoS и ArcAB регулонов 62
4.3 Продукция экстраклеточного супероксида в периодической культуре E. coli 63
4.4 Статус глутатиона в растущей культуре E. coli 64
4.5 Взаимосвязь трансмембранной циркуляции GSH с глобальными регуляторными системами клетки 68
ГЛАВА 5. Влияние экзогенных афк на экспорт глутатиона 73
5.1 Влияние экзогенных АФК, генерируемых ксантиноксидазой, на рост и циркуляцию GSH у бактерий E. coli 73
5.2 Взаимодействие глутатиона с экзогенными АФК 79
5.3 Влияние АФК на жизнеспособность и мембранный потенциал клеток 82
ГЛАВА 6. Взаимосвязь между трансмембранной циркуляцией глутатиона и ионными потоками при изменении доступности фосфата и сульфата в среде 88
6.1 Роль неорганического фосфата и сульфата в циркуляции глутатиона у бактерий E. coli 88
6.2 Изменение и продукции супероксидного радикала при добавлении Pi к голодающим по фосфату клеткам 95
6.3 Влияние искусственных изменений H+ на экспорт глутатиона при добавлении фосфата в голодающую культуру 97
6.4 Изучение связи между экспортом GSH и К+ при добавлении фосфата и сульфата в культуры, голодающие по этим субстратам 99
ГЛАВА 7. Регуляция экспорта глутатиона при аминокислотном голодании 105
7.1 Изменение циркуляции глутатиона и цистеина при аминокислотном голодании и возобновлении роста 105
7.2 Изменение продукции супероксидного радикала при добавлении валина 109
7.3 Изменение циркуляции глутатиона при добавлении низкой концентрации валина и предобработке хлорамфениколом 110
Обсуждение 114
Заключение 123
Литература 127
