Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Применение амплификационных технологий для выявления и идентификации возбудителя холеры 14
1.2 Применение молекулярно-генетических технологий для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы 21
1.3 Совершенствование исследований методом ПЦР с применением генно-инженерных технологий 32
Собственные исследования 35
Глава 2 Материалы и методы 35
2.1 Объекты исследования 35
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 35
2.1.2 Реактивы, питательные среды, диагностические препараты
2.2 Культивирование микроорганизмов 47
2.3 Подготовка проб
2.3.1 Приготовление бактериальных взвесей 47
2.3.2 Подготовка проб биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно контаминированных Bacillus spp. и гетерологичными микроорганизмами 48
2.3.3 Подготовка проб биологического материала и из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных возбудителем холеры и гетерологичными микроорганизмами 49
2.3.4 Подготовка проб воды поверхностных водоемов 51
2.4 Выявление и идентификация холерных вибрионов из воды открытых водоемов с использованием бактериологического анализа 51
2.5 Обеззараживание проб 53
2.5.1 Обеззараживание проб, содержащих микроорганизмы рода Bacillus 53
2.5.2 Обеззараживание проб, содержащих V. cholerae и гетерологичные микроорганизмы з
2.6 Выделение ДНК из бактериальных суспензий, проб биологического материала и из объектов окружающей среды 53
2.7 Полимеразная цепная реакция 54
2.8 Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей 55
2.9 Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGEM, выделение рекомбинантной плазмиды и определение её концентрации 55
2.9.1 Подготовка ампликонов 55
2.9.2 Селекция рекомбинантных клонов 56
2.9.3 Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма Е. coli JM109 56
2.9.4 Определение концентрации ДНК 56
2.9.5 Определение количества ГЭ плазмиды pGEM со вставкой 57
2.10 Статистическая обработка полученных данных 57
Глава 3 Разработка способов выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом пцр с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 58
3.1 Выбор ДНК-мишеней 58
3.2 Подбор специфичных праймеров к выбранным локусам и оптимизация условий амплификации с различным способом учета результатов 72
3.3 Разработка стандартного образца предприятия для оценки эффективности амплификации ctxA и tcpA генов 78
Глава 4 Конструирование наборов реагентов для индикации и идентификации холерных вибрионов методом пцр с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и оценка их диагностической эффективности 82
4.1 Описание тест-систем 82
4.2 Проведение анализа 84
4.3 Оценка чувствительности и специфичности созданных тест-систем в рамках межлабораторных испытаний 93
4.4 Оценка диагностической ценности сконструированного набора реагентов «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» в рамках медицинских испытаний 96
ГЛАВА 5 Апробация сконструированных амплификационных тест-систем при идентификации штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории российской федерации, и при исследовании проб воды открытых водоемов 102
5.1 Идентификация штаммов холерных вибрионов 102
5.2 Проведение мониторинга воды поверхностных водоемов на наличие V. cholerae Ill
Глава 6 Оценка диагностической эффективности набора реагентов «амплисенс bacillus anthracis frt» в рамках медицинских испытаний 115
6.1 Подготовка целевой коллекции штаммов бацилл для оценки эффективности нового препарата для генной диагностики сибирской язвы 115
6.2 Подготовка проб для проведения медицинских испытаний набора реагентов «АмплиСенс Bacillus anthracis-FRT» 118
6.3 Результаты медицинских испытаний набора реагентов «АмплиСенс Bacillus anthracis-FRT»
Заключение 129
Выводы і37
Перечень сокращений, условных обозначений ш
Список использованной литературы i40
