Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Гибридизация клеток как способ изучения взаимодействия геномов 11
1.1.1. Гетерокарионы как модель изучения взаимодействий ядер разного типа 12
1.1.2. Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов 16
1.1.3. Соматические гибридные клетки, полученные при слиянии клеток с разной плоидностью 17
1.2. Свойства стволовых клеток эмбрионального происхождения и получение гибридных клеток между ними и соматическими клетками 18
1.2.1. Характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения 18
1.2.2. Дифференцировка стволовых клеток эмбрионального происхождения in vivo и
in vitro 21 /
1.2.3. Гибридные клетки между соматическими и стволовыми клетками 22
1.2.4. Получение химерных животных с участием гибридных клеток ЭСК-соматическая клетка как метод in vivo оценки их потенциала 25
1.2.5. Репрограммирование генома соматического партнера в гибридных клетках типа
ЭСК -соматическая клетка 26
1.3. Хромосомный состав гибридных клеток 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Клетки и клеточные линии 35
2.2. Условия культивирования клеток 36
2.3. Получение и культивирование клеточных культур и гибридных клеток 37
2.3.1. Получение культур первичных эмбриональных фибробластов 37
2.3.2. Получение линии тетраплоидных фибробластов мыши 37
2.3.3. Получение культуры фибробластов из органов и тканей взрослого животного 39
2.3.4. Получение гибридных клеток 40
2.3.5. Культивирование эмбриональных стволовых клеток и клонов гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты 40
2.3.6. Культивирование фибробластов и гибридных клеток ЭСК-тетраплоидные фибробласты 41
2.4. Анализ маркеров ЭСК в гибридных клетках 41 2.4.1. Оценка активности щелочной фосфатазы 41
2.4.2 Иммунофлуоресцентный анализ Nanog, Oct4, коллагена 1-го типа (Col-1) и фибронектина (Fbn) в ЭСК, фибробластах и гибридных клетках 42
2.4.3. Анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Col l и Fbn с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) 43
2.4.3.1. Выделение РНК 43
2.4.3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) 43
2.5 Идентификация родительских хромосом в клонах гибридных клеток 46
2.5.1. Анализ хромосомного состава с помощью микросателлитных маркеров 46
2.5.1.1. Выделение ДНК 46
2.5.1.2. ПЦР-анализ микросателлитных маркеров 46
2.5.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и подсчет хромосом в клетках 48
2.5.3. In situ гибридизация с хромосомоспецифическими пробами 49
ГЛАВА 3. Результаты 51
3.1 Получение гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты 51
3.2. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-диплоидные фибробласты 52
3.3.Характеристика гибридных клеток типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты 58
3.4. Хромосомный и микросателлитный анализы клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер 61
3.5. Фенотип гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты 66
3.6. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты 67
3.7. Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты 68
ГЛАВА 4. Обсуждение 71
Выводы 77
Список литературы
