ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ...........................................................................................5
1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...........................................................................................................12
2.1. Строение и функции тромбоцитов .....................................................................................12
2.1.1. Образование и клиренс тромбоцитов ..............................................................................13
2.1.2. Строение тромбоцитов......................................................................................................14
2.1.2.1. Плазматическая мембрана и рецепторы тромбоцитов ...............................................14
2.1.2.2. Внутренние мембранные системы................................................................................18
2.1.2.2.1. Открытая канальцевая система ..................................................................................18
2.1.2.2.2. Плотная тубулярная система......................................................................................18
2.1.2.3. Органеллы и гранулы.....................................................................................................19
2.1.2.4. Цитоскелет тромбоцитов ...............................................................................................19
2.1.3. Функциональные реакции тромбоцитов .........................................................................20
2.1.3.1. Адгезия тромбоцитов .....................................................................................................20
2.1.3.2. Изменение формы...........................................................................................................21
2.1.3.3. Реакции высвобождения ................................................................................................21
2.1.3.4. Агрегация тромбоцитов .................................................................................................23
2.2. Тромбоциты, тромбоз и антитромбоцитарные препараты...............................................23
2.2.1. Тромбоциты во внутрисосудистом тромбообразовании ...............................................23
2.2.2. Антитромбоцитарные препараты ....................................................................................24
2.2.2.1. Ингибиторы циклооксигеназы......................................................................................24
2.2.2.2. Антагонисты P2Y12 рецептора АДФ ...........................................................................25
2.2.3. Антагонисты гликопротеина IIb-IIIa ...............................................................................26
2.2.4. Другие препараты с антитромбоцитарным эффектом...................................................26
2.3. Коагуляционная активность тромбоцитов.........................................................................28
2.3.1. Коагуляция крови ..............................................................................................................28
2.3.2. Участие тромбоцитов в коагуляционных реакциях.......................................................29
2.3.3. Коагуляционная активность тромбоцитов и антитромбоцитарные препараты ..........33
2.4. Микрочастицы тромбоцитов ...............................................................................................34
2.4.1. Виды мембранных частиц ................................................................................................34
2.4.2. Коагуляционная активность тромбоцитарных микрочастиц........................................36
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................................................38
3.1. Реактивы................................................................................................................................38
3.2. Доноры и пациенты..............................................................................................................39
3.2.1. Здоровые добровольцы и пациенты ................................................................................393
3.3. Забор крови ...........................................................................................................................40
3.4. Получение отмытых тромбоцитов для теста рекальцификации, теста генерации
тромбина и исследования фосфатидилсерина ..........................................................................41
3.5. Агрегация тромбоцитов .......................................................................................................41
3.6. Модифицированный тест рекальцификации плазмы .......................................................43
3.6.1. Получение субстратной плазмы.......................................................................................43
3.6.2. Проведение модифицированного теста рекальцификации плазмы .............................43
3.7. Тест генерации тромбина ....................................................................................................44
3.8. Подбор условий иммобилизации тромбоцитов для теста рекальцификации и теста
генерации тромбина ....................................................................................................................46
3.8.1. Оценка иммобилизации тромбоцитов с помощью световой микроскопии.................46
3.8.2. Оценка иммобилизации радиоактивно меченых тромбоцитов ....................................46
3.8.2.1 Мечение антител с помощью
125
I...................................................................................46
3.8.2.2 Связывание антител с тромбоцитами............................................................................47
3.8.2.3 Количественная оценка иммобилизации радиоактивно меченых тромбоцитов.......47
3.9. Определение экспонирования фосфатидилсерина на поверхности тромбоцитов
методом проточной цитофлуориметрии ...................................................................................47
3.9.1. Подготовка проб для исследования уровня экспонирования фосфатидилсерина на
поверхности отмытых тромбоцитов..........................................................................................47
3.9.2. Подготовка проб для исследования уровня экспонирования фосфатидилсерина на
поверхности тромбоцитов в цельной крови .............................................................................48
3.9.3. Анализ экспонирования фосфатидилсерина...................................................................49
3.10. Исследование прокоагулянтных свойств мембранных микрочастиц тромбоцитов....49
3.10.1. Получение микрочастиц .................................................................................................49
3.10.2. Тест рекальцификации плазмы ......................................................................................50
3.10.3. Подсчет количества микрочастиц..................................................................................50
3.11. Статистический анализ полученных данных...................................................................51
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .......................................................................................52
4.1. Разработка модифицированного теста рекальцификации плазмы для оценки
прокоагулянтных свойств тромбоцитов....................................................................................52
4.1.1. Подбор условий проведения модифицированного теста рекальцификации плазмы .52
4.2. Влияние различных агонистов на прокоагулянтные свойства тромбоцитов .................57
4.2.1. Влияние различных агонистов на способность тромбоцитов ускорять образование
фибрина ........................................................................................................................................57
4.2.2. Влияние различных агонистов на способность тромбоцитов ускорять образование
тромбина.......................................................................................................................................59
4.2.3. Влияние различных агонистов на экспонирование тромбоцитами фосфатидилсерина
.......................................................................................................................................................634
4.3. Влияние антитромбоцитарных препаратов на прокоагулянтные свойства тромбоцитов
.......................................................................................................................................................69
4.3.1. Влияние антитромбоцитарных препаратов на способность тромбоцитов ускорять
образование фибрина ..................................................................................................................69
4.3.2. Влияние антитромбоцитарных препаратов на способность тромбоцитов ускорять
образование тромбина.................................................................................................................72
4.3.3. Влияние антитромбоцитарных препаратов на экспонирование тромбоцитами
фосфатидилсерина.......................................................................................................................75
4.3.3.1. Влияние антитромбоцитарных препаратов на экспонирование тромбоцитами
фосфатидилсерина в условиях in vitro.......................................................................................75
4.3.3.2. Влияние антитромбоцитарных препаратов, принимаемых пациентами на
экспонирование тромбоцитами фосфатидилсерина ................................................................79
4.4. Исследование прокоагулянтных свойств тромбоцитарных микрочастиц......................80
4.4.1. Исследования способности тромбоцитарных микрочастиц ускорять образование
фибрина ........................................................................................................................................80
4.4.2. Подсчет количества микрочастиц и определение уровня экспонирования
фосфатидилсерина.......................................................................................................................82
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................................................................87
5.1. Оценка прокоагулянтных свойств тромбоцитов, активированных различными
агонистами ...................................................................................................................................87
5.2 Влияние антитромбоцитарных препаратов на прокоагулянтные свойства тромбоцитов
.......................................................................................................................................................90
5.3. Исследование прокоагулянтных свойств тромбоцитарных микрочастиц......................94
6. ВЫВОДЫ .................................................................................................................................95
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................97
