Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Особенности строения и функционирования ПЧКК 8
1.1.1. Молекулярная организация 9
1.1.2. Селективность действия 11
1.1.3. Гомо- и гетеромультимеризация 12
1.1.4. Вспомогательные субъединицы 14
1.1.5. Сборка канала и транспорт в цитоплазматическую мембрану 14
1.1.6. Особенности активации и инактивации 15
1.2. Семейство каналов Kv1 19
1.2.1 Характеристика представителей 19
1.2.2. Регуляция работы каналов на уровне организма 24
1.2.3. Участие в регуляции клеточного цикла .27
1.2.4. Участие в развитие опухолей 28
1.2.5. Участие в апоптозе 31
1.2.6. Митохондриальная локализация каналов и апоптоз 33
1.2.7. Ассоциированные заболевания 36
1.2.7.1. Аутоиммунные заболевания .37
1.2.7.2. Нейрофизиологические отклонения 40
1.2.7.3. Астма 41
1.2.7.4. Заболевания пародонта 41
1.2.8. Функции в метаболизме 42
1.3 Модуляторы каналов семейства Kv1 43
1.3.1. Пептидные лиганды ядов 43
1.3.1.1. Токсины морских улиток 44
1.3.1.2. Токсины ядов змей 45
1.3.1.3. Токсины пауков 45
1.3.1.4. Токсины актиний 46
1.3.1.5. Токсины скорпионов .46
1.3.2. Непептидные лиганды 50
1.3.2.1. Неселективные блокаторы калиевых каналов 50
1.3.2.2. Селективные блокаторы каналов семейства Kv1 51
1.4. Методы поиска и исследования новых блокаторов Kv1-каналов 58
Глава 2. Материалы и методы .64
2.1. Реагенты .64
2.2. Клонирование и экспрессия гибридных белков KcsA-Kv1.x (x=1,3,6) 65
2.3. Приготовление сферопластов из клеток E. coli BL21(DE3) 66
2.4. Методика проведения экспериментов по анализу взаимодействия лигандов каналов Кv1.x с гибридными белками KcsA-Kv1.x (x=1,3,6) в составе мембраны сферопластов 66
2.5. Получение флуоресцентных изображений 67
2.6. Анализ данных 67
2.7. Методика поиска лигандов каналов Кv1.x в ядах животных 68
2.7.1. Анализ ядов пауков и секрета жабы 69
2.7.2. Анализ ядов змей 69
2.7.3. Фракционирование и анализ яда скорпиона H. laoticus 69
2.7.4. Анализ ядов скорпионов B. arenicola и A. amoreuxi.
Фракционирование и анализ ядов скорпионов O. scrobiculosus и M.
eupeus 70
Глава 3. Результаты и обсуждение 72
3.1. Разработка флуоресцентной методики измерения и анализа взаимодействия лигандов с гибридными белками KcsA-Kv1.х на поверхности мембраны сферопластов 72
3.1.1. Подбор условий детекции взаимодействия R-AgTx2 с гибридными белками KcsA-Kv1.x (x=1,3,6) на поверхности мембраны сферопластов методом ЛСКМ 73
3.1.2. Разработка методики измерения констант диссоциации комплексов лигандов с гибридными белками KcsA-Kv1.x (x=1,3,6) 79
3.2. Разработка состава и оптимизация свойств компонентов клеточных систем. Разработка протоколов подготовки компонентов к измерениям 84
3.2.1. Оптимизация экспрессии гибридных белков KcsA-Kvl.x (x=1,3,6) в составе мембраны E. сoli 84
3.2.2. Изучение влияния компонентов буфера на результаты измерений связывания лигандов с гибридными белками Kv1.x (x=1,3,6) 89
3.3. Характеристика специфичности взаимодействия клеточных систем с известными лигандами Кv1-каналов 94
3.4. Анализ структурных особенностей взаимодействия пептидов AgTx2, KTX и OSK1 с гибридными белками KcsA-Kv1.x (x=1,3,6) 98
3.5. Поиск высокоаффинных пептидных лигандов Kv1-каналов в ядах животных при помощи разработанных клеточных систем 102
3.5.1. Анализ ядов пауков 105
3.5.2. Анализ ядов змей 106
3.5.3. Анализ яда скорпиона H. laoticus и его компонентов 108
3.5.4. Анализ яда скорпиона O. scrobiculosus и его компонентов 111
3.5.5. Анализ яда скорпиона M. eupeus и его компонентов 115
Заключение 120 Выводы 122 Благодраности 123
Список процитированной литературы
