Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Токсины энтеробактерий 12
1.1.1. Энтеротоксины 15
1.1.1.1. ST-энтеротоксины 16
1.1.1.2. Термолабильный энтеротоксин 16
1.2. Распространение способности токсинообразования среди различных групп микроорганизмов 18
1.3. Методы культивирования токсигенных эшерихий 21
1.4. Методы выделение и очистки термолабильного энтеротоксина 23
1.5. Методы обнаружения термолабильного энтеротоксина 25
1.5.1. Методы биологического обнаружения термолабильного энтеротоксина 26
1.5.2. Иммунохимические методы диагностики термолабильного энтеротоксина 28
1.5.3. Другие методы детекции термолабильного энтеротоксина... 32
1.6. Моноклональные антитела 33
Глава 2. Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы 36
2.1.1. Штаммы бактерий 36
2.1.2. Лабораторные животные 36
2.1.3. Среды для культивирования микроорганизмов и клеточных культур 36
2.1.4. Буферные растворы 37
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Получение биомассы штамма продуцента термолабильного энтеротоксина 38
2.2.2.1. Получение препаратов термолабильного энтеротоксина ультразвуком 38
2.2.1.2. Экстракция термолабильного энтеротоксина из клеток продуцентов 8М мочевиной 39
2.2.1.3. Выделение термолабильного энтеротоксина с использованием лизоцима 39
2.2.2. Осаждение термолабильного энтеротоксина сульфатом аммония 39
2.2.3. Гель-фильтрация 40
2.2.4. Аффинная хроматография 40
2.2.5. Определение концентрации белка 40
2.2.6. Электрофорез в ПААГе 41
2.2.7. Иммуноблотинг 42
2.2.8. Определение антигенной активности 43
2.2.9. Реакция радиальной иммунодифузии по
Ухтерлони 43
2.2.10. Тест на биологическую активность термолабильного энтеротоксина 43
2.2.11. Получение поликлональных антител 44
2.3. Методы работы с культурами клеток 45
2.3.1. Клонирование гибридом 45
2.3.2. Хранение клеток 45
2.3.3. Размораживание клеток 46
2.3.4. Получение препаративного количества мкАт 46
2.3.5. Очистка мкАт с помощью ионообменной хроматографии... 46
2.4. Иммуноферментный анализ 47
2.4.1. Приготовление конъюгата мкАт и поликлональных антител
с пероксидазой хрена 47
2.4.2. Приготовление проявляющего раствора 48
2.4.3. Непрямой метод иммуноферментного анализа 48
2.4.4. Двухцентровой метод иммуноферментного анализа 49
2.4.5. Определение токсигенности бактериальных штаммов 49
2.5. Иммунохроматографический анализ 50
Глава 3. Результаты исследований 51
3.1. Выделение и очистка термолабильного энтеротоксина эшерихии. . 51
3.1.1. Получение биомассы штамма продуцента 51
3.1.2. Получение грубых-экстрактов штамма продуцентов 51
3.1.3. Фракционирование грубого экстракта сульфатом аммония ... 51
3.1.4. Очистка препарата энтеротоксина посредство гель -фильтрации 52
3.1.5. Аффинная хроматография на голубой агарозе 54
3.1.6 Определение чистоты полученных препаратов
термолабильного энтеротоксина 55
3.1.7. Определение антигенной активности термолабильного энтеротоксина 57
3.1.8. Определение биологической активности термолабильного энтеротоксина 57
3.1.9. Определение специфичности мкАт с использованием иммуноблотинга 58
3.2. Получение поликлональной антисыворотки против
термолабильного энтеротоксина 60
3.2.1. Выделение и очистка поликлональных антител из антитоксической сыворотки 61
3.2.2. Хроматография поликлональной сыворотки на DEAE Toyopearl 650М 62
3.2.3. Определение специфичности препаратов поликлональных антител 63
3.2.4. Получение конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой хрена 64
3.2.5. Подбор оптимальных условий для сорбции поликлональных антител на пластик 66
3.3. Получение и очистка препаративных количеств мкАт 67
3.3.1. Использование перитониальных макрофагов 67
3.3.2. Получение препаративных количеств мкАт 68
3.3.3. Хроматографическая очистка мкАт на сорбенте DEAE-Toyopearl 650М 68
3.3.4. Определение чистоты полученных препаратов мкАт 70
3.3.5. Исследования используемых мкАт методом ИФА 71
3.3.5.1. Получение конъюгатов мкАт с пероксидазой хрена ... 71
3.3.5.2. Подбор специфической пары мкАт для обнаружения термолабильного энтеротоксина 72
3.3.5.3. Определение оптимальных условий сорбции мкАт
на иммунологические планшеты 72
3.4. Создание иммуноферментной тест-системы для определения
термолабильного энтеротоксина 73
3.4.1. Аналитические параметры иммуноферментной тест-системы
для обнаружения термолабильного энтеротоксина 75
3.5. Определение термолабильного энтеротоксина при помощи иммунохроматографического анализа 77
3.6. Испытание иммуноферментной тест системы 79
3.6.1. Анализ бактериальных штаммов на токсинообразование 79
3.6.2. Определение термолабильного энтеротоксина в кормах 84
3.6.3. Определение термолабильного энтеротоксина
в биологических образцах 86
Глава 4. Обсуждение результатов 88
Выводы 95
Библиографический список 96
Приложения 118
