Введение
1.Обзор литературы 10
1.1. Гидрогеназы: строение, свойства, функции .10
1.1.1. Роль гидрогеназ in vivo. 11
1.1.2. Классификация гидрогеназ на основе строения активного центра
1.1.2.1. [Fe]-гидрогеназы .19
1.1.2.2. [FeFe]- гидрогеназы .20
1.1.2.3. [NiFe]- гидрогеназы
1.1.2.3.1. Строение [NiFe]- гидрогеназ 23
1.1.2.3.2. Активный центр. Каталитический цикл 27
1.1.2.3.3. Инактивация гидрогеназ .29
1.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS 32
1.2.1. Общая характеристика Thiocapsa roseopersicina BBS 32
1.2.2. Гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina BBS
1.2.2.1. HupSL-гидрогеназа 35
1.2.2.2. HupUV-гидрогеназа 36
1.2.2.3. Hox 1-гидрогеназа 37
1.2.2.4. Hox 2-гидрогеназа 38
1.2.2.5. HynSL-гидрогеназа 39
1.2.3. Созревание гидрогеназ в Thiocapsa roseopersicina 41
1.3. Биосенсоры 42
1.3.1 Общие принципы строения 42
1.3.2. Преобразователи сигнала 43
1.3.3. Чувствительные (распознающие) элементы 45
1.3.4. Ферментные электрохимические сенсоры
1.3.4.1. Прямой и медиаторный биоэлектрокатализ 49
1.3.4.2. Методы иммобилизации ферментов 51
Материалы и методы .57
2.1. Культуры микроорганизмов 57
2.1. Культивирование микроорганизмов
2.3. Получение биомассы 58
2.4. Газовая хроматография 58
2.5. Определение видовой принадлежности микроорганизмов 59 2.6. Методы долговременного хранения T. roseopersicina 60
2.6.1. Лиофилизация 60
2.6.2. Тест на ускоренное хранение 61
2.6.3. Хранение при низких температурах (-80С) 2.7. Выделение и очистка гидрогеназы 63
2.8. Измерение гидрогеназной активности .65
2.9. Изготовление ферментных электродов 65
2.10. Электрохимические измерения 66
3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Определение видовой пренадлежности 68
3.2. Культивирование штамма-продуцента .68
3.3. Долговременное хранение T. roseopersicina BBS .
3.3.1. Хранение T. roseopersicina при низких температурах (-80С). 71
3.3.2. Лиофильное высушивание T. roseopersicina 73
3.3.2.1. Прогнозирование сроков хранения культуры. 75
3.3.2.2. Оценка гидрогеназной активности клеток после хранения культуры в лиофилизированном виде. 80
3.4. Выделение и очистка гидрогеназы из T. roseopersicina BBS 80
3.5. Оценка электрохимических характеристик ферментного электрода на основе гидрогеназы T.roseopersicina BBS .88
3.5.1. Метод электрохимических измерений 88
3.5.2. Кинетические характеристики катализа иммобилизованной на электрод гидрогеназой .90
3.5.3. Биоэлектрокатализ гидрогеназами в присутствии промотора – нейтрального красного .93
3.5.4. Электрохимическе характеристики электрода с иммобилизованной гидрогеназой, полученной по модифицированной схеме очистки 94
3.5.5. Исследование зависимости электрохимических характеристик ферментных электродов от парциального давления водорода .95
3.5.6. Влияние метана и двуокиси углерода на электрохимическую активность гидрогеназных электродов .100
3.5.7. Измерение водорода непосредственно в среде культивирования микроорганизмов .105
Заключение 109
Выводы 113
Список литературы .114
Благодарности
