Введение
II. Литературный обзор 8
1. Введение 8
2. Обзор научно-технической литературы 9
2.1. Инсулин, строение и синтез в клетке. 9
2.1.1. Метаболизм глюкозы в организме человека 10
2.1.2. Роль инсулина в лечении сахарного диабета 11
2.2. Производство генно-инженерного инсулина человека на ОБП ИБХ РАН 14
2.2.1. Перечень основных технологических операций в производстве инсулина 14
2.2.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленной ферментации 14
2.2.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения и очистки 14
2.2.1.3 Технологические операции, выполняемые в цехе готовых лекарственных форм 15
2.2.2. Требования к контролю качества субстанции генно-инженерного инсулина человека 15
2.3. Белки гистоны, их строение и синтез в клетке. 20
2.3.1. Гистоны как основа терапевтических средств 23
2.4. Разработка биотехнологии получения активной фармацевтической субстанции – аналога
Ритуксимаба. 26
2.4.1. Перечень основных технологических операций в производстве субстанции гистона H1.3 26
2.4.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленной ферментации 26
2.4.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения и очистки 27
2.4.1.3. Контроль качества АФС, физико-химические свойства
2.5. Система управления рисками на производстве генно-инженерных белков 29
2.6. Общая политика валидации на фармацевтическом производстве
2.6.1. Необходимость валидации аналитических методик 31
2.6.2. Валидационные параметры. 32
2.6.3. Методы анализа, основанные на связывании лигандов
2.7. Методы определения остаточной ДНК и белков штамма-продуцента в активной фармацевтической субстанции 37
2.8. Метод полимеразной цепной реакции.
2.8.1. Основы метода ПЦР 41
2.8.2. Детекция проведения амплификации (электрофорез) 46
2.8.3. ПЦР в режиме реального времени.
2.8.3.1. Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «в реальном времени». 50
2.8.3.2. ПЦР в режиме реального времени в качестве диагностического инструмента. 51
2.8.3.3. Типы ПЦР в режиме реального времени. 52
2.8.3.4. Оборудование для ПЦР в реальном времени. 59
2.9. Метод иммуноферментного анализа. 61
2.9.1. Основы метода ИФА. 61
2.9.2. Индикация комплекса антиген-антитело.
2.9.2.1. Ферменты в качестве меток в иммуноанализе. 64
2.9.2.2. Получение конъюгатов для иммуноферментного анализа.
2.9.3. Методы получения антител для ИФА. 67
2.9.4. Классификация методов иммуноферментного анализа. 68
2.9.4.1. Схемы методов твердофазного ИФА. 70
2.9.5. Интерпретация результатов ИФА 74
III. Экспериментальная часть 77
1. Объекты исследования 77
2. Методы исследования 78
2.1. Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулина и гистона Н1.3 . 78
2.1.1. Наращивание биомассы 78
2.1.2. Выделение тотальной и плазмидной ДНК. 78
2.1.3. Обработка ДНК ультразвуком, ДНКазой 79
2.1.4. Пробоподготовка АФС. 79
2.1.5. Проведение ПЦР и рвПЦР на основе интеркалирующего красителя SYBR GREEN I и технологии TaqMan, основанной на введении в реакцию флуоресцентно-меченых зондов. 80
2.1.6. Подготовка образцов к секвенированию. 82
2.2. Определение содержания проинсулина в АФС инсулина методом ELISA. 83
2.2.1. Буфер для проб. 83
2.2.2. Пробоподготовка АФС инсулина 83
IV. Результаты и обсуждение 84
1. Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,
на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого и
генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого. 84
1.1. Создание рабочего стандартного образца на основе тотальной ДНК штамма-продуцента инсулина.
1.2. Оптимизация пробоподготовки АФС для определения остаточной ДНК штамма-продуцента методом рвПЦР. 86
1.3. Подбор компонентов и условий проведения реакций рвПЦР с использованием SYBR GREEN I и технологии TaqMan.
1.3.1. рвПЦР с использованием SYBR GREEN I 88
1.3.2. рвПЦР с использованием технологии TaqMan 1.4. Определение диапазона фрагментов остаточной ДНК в субстанции генно-инженерного инсулина человеческого при помощи фосфора Р32. 98
1.5. Оценка содержания остаточной ДНК в АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого при помощи праймеров к ампликонам размером 100 п.о. и 198 п.о. 99
1.6. Исследование содержания остаточной ДНК штамма-продуцента гистона методом капельной цифровой ПЦР (кцПЦР) на основе TaqMan проб. Сравнение результатов реакции для разработанного и коммерческого TaqMan зондов
1 2. Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологии TaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС . 106
3. Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBR GREEN I и параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies по определению остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерного инсулина человека и генно-инженерного гистона Н1.3 человека. 107
4. Сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определения проинсулина в генно-инженерной субстанции инсулина на основе набора для плазмы крови, с соответствующими параметрами другого набора, предназначенного для оценки содержания проинсулина в субстанции инсулина. 109
V. Выводы 118
VI. Список опубликованных научных работ по теме диссертации.
119
VII. Благодарности. 120
VIII. Список литературы. 121
