Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор
1.1. Вирусные болезни малины 14
1.2. Симптомы поражения ВККМ и круг хозяев 19
1.3. Генетическое разнообразие и распространение ВККМ 22
1.4. Изоляты ВККМ 25
1.5. Систематическое положение и молекулярные характеристики ВККМ .. 26
1.6. Методы диагностики ВККМ 31
1.7. Реакция амплификации по типу катящегося кольца (RCA) 34
1.8. Эффективность различных методов оздоровления растений малины от вируса кустистой карликовости 41
1.9. Перспективы создания устойчивых к ВККМ растений малины 44
1.10. Получение трансгенной устойчивости растений к вирусам 49
1.10.1. Методы трансформации растительных клеток 49
1.10.1. 1. Методы прямой трансформации клеток 49
1.10.1. 2. Трансформация с помощью векторов на основе Ti-плазмид 52
1.10.2. Основные принципы создания генетических конструкций для
создания трансгенных растений 55
1.10.3. Получение резистентности к вирусам на уровне генома 60
1.10.3.1. Пост-транскрипционное замолкание генов (PTGS) 64
ГЛАВА 2. Материалы, методы и условия исследования
2.1 Материалы, используемые в работе 69
2.1.1. Сорта ремонтантной малины, используемые в исследовании 69
2.1.2. Векторы, используемые для получения генетических конструкций 70
2.2.Методика клонального микроразмножения 72
2.3. Выделение тотальной РНК из растительного материала 73
2.4. Разработка методики анализа ВККМ на основе реакции амплификации по типу катящегося кольца (RCA) 74
2.4.1. Лигазная реакция 75
2.4.2. Реакция амплификации по принципу катящегося кольца в режиме реального времени (Realime RCA) 75
2.5. Создание генетических конструкций, содержащих фрагменты генов ВККМ 76
2.5.1. Получение вирусспецифичных фрагментов 76
2.5.2. Лигирование вирусспецифичных фрагментов ВККМ в бинарный вектор 77
2.5.3. Трансформация клеток E. сoli генетическими конструкциями на основе фрагментов генов ВККМ
2.5.3.1. Электропорация клеток E. сoli 78
2.5.3.2. Химическая трансформация клеток E. сoli 79
2.6.3. Выделение и анализ плазмидной ДНК 80
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Культивирование малины in vitro и характеристика исходного материала на наличие ВККМ 81
3.1.1. Культивирование новых ремонтантных сортов и форм малины in vitro 81
3.1.2. Встречаемость вируса кустистой карликовости малины при семенном и вегетативном размножении 85
3.2. Характеристика генетического родства местных изолятов ВККМ и подбор консервативных последовательностей гена полипротеина и гена транспортного белка 92
3.2.1. Создание генетических конструкций на основе фрагментов гена транспортного белка и гена белка оболочки ВККМ 93
3.2.2. Подбор консервативных последовательностей гена полипротеина и гена транспортного белка 103
3.3. Диагностика вируса кустистой карликовости малины с помощью реакции амплификации по принципу катящегося кольца 106
3.3.1. Характеристика циклизующихся проб, используемых для диагностики ВККМ методом RCА 106
3.3.2. Подбор положительных контролей для проведения RCA-диагностики ВККМ 112
3.3.3. Подбор ДНК-полимераз для проведения диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с детекцией в режиме реального времени 113
3.3.3.1. Эффективноть Vent ДНК-полимеразы для проведения реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца 115
3.3.3.2. Эффективность использования Pfu ДНК-полимеразы для диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца 130
3.3.3.3.Эффективность использования Taq ДНК-полимераз для проведения реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца 134
3.3.4. Сравнение эффективности применения циклизующихся проб RBDVcirP и RBDVcirМP для диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с детекцией в режиме реального времени 146
3.3.5. Влияние белковых и полифенольных примесей в препарате тотальных нуклеиновых кислот на проведение диагностики ВККМ с помощью реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца с
детекцией в режиме реального времени 149
Заключение 155
Выводы 159
Рекомендации производству 161
Список используемой литературы
