Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Краткая характеристика клинически значимых кишечных вирусов 13
1.1.1. Общая характеристика семейства Picornaviridae 13
1.1.2. Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae 23
1.1.2.1. Полиовирусы 23
1.1.2.2. Вирусы Коксаки, ECHO и Энтеровирусы 68-71 25
1.1.2.3. Парэховирусы 26
1.1.2.4. Вирус гепатита А 28
1.1.3. Устойчивость энтеровирусов к воздействию физических и химических факторов 32
1.1.4. Общая характеристика семейства Adenoviridae 33
1.1.5. Ротавирусы, астровирусы, коронавирусы и калицивирусы 39
1.2. Методы выявления кишечных вирусов в воде 43
1.2.1. Методы концентрирования вирусов из воды 44
1.2.2. Диоксид кремния. Принципы адсорбции белков и вирусов на силикагелях 47
1.2.3. Методы выявления кишечных вирусов 49
1.2.4. Молекулярные методы исследования 53
Глава 2. Материалы и методы исследования 60
2.1. Материалы 60
2.1.1. Культуральные штаммы вирусов 60
2.1.2. Клинические образцы и образцы сточных вод 60
2.1.3. Клеточные линии 60
2.1.4. Реактивы , 61
2.2. Методы 61
2.2.1. Молекулярно-биологические методы 61
2.2.2. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды 62
2.2.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды 63
2.2.4. Пробоподготовка 63
2.2.4.1. Приготовление фекальных суспензий 63
2.2.4.2. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из биологического материала 64
2.2.5. Реакция обратной транскрипции (ОТ) 64
2.2.6. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной
детекцией в режиме реального времени (Taq-Man) 65
2.2.7. Количественная ПЦР-РВ 65
2.2.7.1. Приготовление калибраторов 65
2.2.7.2. Построение калибровочных прямых 66
2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле 67
2.2.9. Метод трансмиссивной электронной микроскопии 68
2.2.10. Методы выявления и идентификации кишечных вирусов 68
2.2.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 68
2.2.12. Статистическая обработка результатов исследований 69
Глава 3. Разработка методов концентрирования вирусов из воды 70
3.1. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды 72
3.2. Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот 77
3.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды на сорбентах ММиММ+ 82
Глава 4. Разработка метода мультиплексной пцр-рв с впк для выявления днк и рнк кишечных вирусов 90
4.1. Подбор праймеров и зондов 90
4.2. Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов 93
4.3. Оптимизация условий ОТ и ПЦР 94
4.4. Оценка чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ 100
4.5. Разработка методов количественной оценки ДНК
и РНК кишечных вирусов 102
Глава 5. Исследование клинических образцов и образцов сточных вод методом ПЦР-РВ 105
5.1. Анализ клинических образцов методом ПЦР-РВ 105
5.2. Анализ сточных вод методом ИКМ-ІІЦР-РВ 108
5.3. Анализ образцов сточных вод методом ПЦР-РВ 110
Выводы 112
Благодарности 113
Список литературы
