Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1. Вирус гепатита В 17
1.1. Строение вируса гепатита В и структура генома 17
1.2. Цикл ВГВ 19
1.3. Регуляция репликации вируса 20
1.4. Особенности хронической инфекции и современные подходы к терапии 21
1.5. КкзДНК ВГВ как основная причина персистенции вируса 22
2. Системы сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 25
2.1. Системы сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9: классификация и принципы действия 25
2.2. Целевая и внецелевая активность CRISPR/Cas9 29
3. Описание ортологичных систем CRISPR/Cas9 32
4. Системы CRISPR/Cas9 и ВГВ 33
5. Системы CRISPR/Cas9 как основа для создания противовирусных препаратов препаратов 34
Глава 2 Материалы и методы исследований 36
1. Культуры клеток 36
2. Трансфекция линий клеток 36
3.Синтез рекомбинантной ккзДНК ВГВ 37
4. Дизайн и получение компонентов систем CRISPR/Cas9 37
5. Выделение нуклеиновых кислот 38
6. ПЦР-анализ 39
7. Определение HBsAg 39
8. Иммуноцитохимическое окрашивание 39
9. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия 40
10. Анализ целевого и внецелевого действия методом секвенирования нового поколения 40
11. Статистическая обработка данных 41
Глава 3. Анализ противовирусного действия ортологичных систем CRISPR/Cas9 43
3.1. Дизайн и синтез РНК-проводников 43
3.2. Поиск консервативных регионов-мишеней для CRISPR/Cas9 в геноме вируса гепатита В разных генотипов 48
3.3. Влияние ортологичных систем CRISPR/Cas9 на жизненный цикл вируса гепатита В 51
3.4. Деградация рекомбинантной ккзДНК под действием ортологичных систем CRISPR/Cas9. 61
3.5. Системы CRISPR/Cas9 эффективно подавляют репликацию ВГВ на стабильных клеточных линиях 63
3.6. Нуклеолитическое разрезание ккзДНК системами CRISPR/Cas9 68
Глава 4. Специфичность действия ортологичных систем CRISPR/Cas9 72
4.1. Сравнение внецелевой активности классической системы S. pyogenes CRISPR/Cas9 и ортологичной системы S.thermophilus CRISPR/Cas9 72
4.2. Влияние несовпадений нуклеотидов между последовательностями РНК-проводника и ДНК-мишенью системы S.thermophilus CRISPR/Cas9 76
Обсуждение 81
Заключение 86
Выводы 87
Перспективы дальнейшей разработки темы 88
Список литературы 91
