Введение
1. Характеристика выделяемых объектов 10
1.1. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор 10
1.1.1. Функции 10
1.1.2. Структура 10
1.1.3. Секреция и механизм действия 13
1.1.4. Применение препарата рчГ-КСФ в медицинской практике.... 14
1.2. Соматотропин 15
1.2.1 Функции 15
1.2.2. Структура 16
1.2.3. Секреция и механизм действия 17
1.2.4. Свойства рекомбинантного ГРЧ 20
1.2.5. Применение препарата ГРЧ в медицинской практике 22
2. Солюбилизация и ренатурация эукариотических белков, экспрессируемых в Е. coli в виде телец включения 23
2.1. Введение 23
2.2. Характеристика телец включения 23
2.3. Фолдинг белков в живой клетке 25
2.4. Промежуточные состояния и их роль в образовании агрегированных форм белка 28
2.5. Ренатурация белков in vitro 30
2.6. Методы солюбилизации и ренатурации белков, формирующих тельца включения 31
2.6.1. Традиционные методы 31
2.6.2. Методы, позволяющие улучшить проведение процесса ренатурации белка, полученного из телец включения 33
2.6.3. Новейшие методы солюбилизации белков, позволяющие добиться высокого выхода белка после ренатурации 34
3. Требования зарубежных фармакопей к фармацевтическим генно-инженерным препаратам 36
3.1. Введение 36
3.2. Определяемые примеси и методы контроля 37
3.3. Эндотоксины 38
3.3.1. Методы определения эндотоксинов 40
3.3.2. Взаимодействие эндотоксинов с белками 42
3.3.3. Методы удаления эндотоксинов 43
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47
1. Оборудование, реактивы, сорбенты 47
2. Методы 49
2.1. Аналитические методы 49
2.2. Препаративные методы 54
3. Математические расчеты 58
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 59
1. Оптимизация процесса ренатурации Met-рГРЧ и рчГ-КСФ 59
1.1. Введение 59
1.2. Солюбилизация в мягких условиях (Схема 1) 59
1.3. Солюбилизация в жестких условиях (Схема 2) 65
1.4. Масштабирование процесса ренатурации 69
2. Подбор условий очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ 71
2.1. Ионообменная хроматография 71
2.1.1. Исследование влияния рН и размера частиц сорбента на процесс ИОХ 71
2.1.2. Определение динамической емкости сорбента 74
2.1.3. Определение рабочей скорости проведения ИОХ 76
2.2. Оценка чистоты Met- рГРЧ и рчГКСФ после ИОХ 797
2.3. Подбор условий отщепления N-концевого метионина от Met-рГРЧ.. 79
2.4. Гидрофобная хроматография 81
2.5. Масштабирование процессов очистки 86
3. Анализ качества выпускаемых препаратов 93
3.1. Анализ рГРЧ 93
3.2. Анализ рчГКСФ 97
ВЫВОДЫ 100
БЛАГОДАРНОСТИ 101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102
