Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1 Характеристика возбудителя туляремии 15
1.2 Методы лабораторной диагностики туляремии 22
1.2.1 Применение ПЦР для детекции возбудителя туляремии 23
1.2.2 Применение ПЦР для внутривидовой дифференциации возбудителя туляремии 30
1.2.3 Применение мультилокусной ПЦР для обнаружения и идентификации F. tularensis комплексе с другими возбудителями особо опасных инфекций 36
1.2.4 Другие молекулярно-биологические методы, применяемые для лабораторной диагностики туляремии 40
Собственные исследования 44
Глава 2 Материалы и методы 44
2.1 Объекты исследования 44
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 44
2.1.2 Реактивы, питательные среды и диагностические препараты
2.2 Культивирование микроорганизмов 53
2.3 Подготовка проб для молекулярно-генетических исследований
2.3.1 Приготовление бактериальных взвесей 54
2.3.2 Подготовка проб полевого материала 55
2.3.3 Приготовление проб клинического, биологического материала и из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных возбудителем туляремии и гетерологичными микроорганизмами 55
2.4 Проведение лабораторных исследований проб биологического материала от животных с экспериментальной туляремийной инфекцией 57
2.4.1 Характеристика лабораторных животных, использованных в экспериментальных исследованиях 57
2.4.2 Заражение лабораторных животных культурой F. tularensis 57
2.4.3 Подготовка проб биологического материала от животных с экспериментальной туляремийной инфекцией 58
2.4.4 Выявление антигенов туляремийного микроба методом иммуноферментного анализа 59
2.4.5 Обнаружение возбудителя туляремии методом иммунохроматографического анализа 59
2.4.6 Детекция F. tularensis методом люминесцентной микроскопии 59
2.4.7 Выявление туляремийного микроба методом световой микроскопии 59
2.4.8 Бактериологический анализ для обнаружения возбудителя туляремии
2.5 Обеззараживание проб для молекулярно-генетических исследований 60
2.6 Выделение ДНК из бактериальных суспензий микроорганизмов, проб клинического, биологического материала и объектов окружающей среды .
2.7 Полимеразная цепная реакция 61
2.7.1 Внутривидовая дифференциация туляремийного микроба методом ПЦР 62
2.8 Секвенирование фрагментов ДНК 62
2.9 Статистическая обработка полученных данных 62
Глава 3 Разработка наборов реагентов для выявления ДНК возбудителя туляремии методом пцр с электрофоретической и гибридизационно флуоресцентной детекцией и оценка их диагностической ценности
3.1 Подбор ДНК-мишени, олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления возбудителя туляремии методом ПЦР
3.2 Разработка ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для детекции ДНК возбудителя туляремии
3.3 Конструирование генодиагностических препаратов для выявления возбудителя туляремии методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и оценка их диагностической ценности
Глава 4 Оценка диагностической эффективности пцр с использованием разработанных наборов реагентов «ген francisella tularensis – рэф» и «ген francisella tularensis – ргф» при анализе проб от животных с экспериментальной туляремией
Глава 5 Апробация разработанных тест-систем при проведении эпизоотологического мониторинга территорий российской федерации на наличие туляремийного микроба 97
Глава 6 Разработка методических приемов для внутривидовой дифференциации штаммов francisella tularensis с помощью молекулярно-генетических подходов
Заключение 119
Выводы 128
Перечень сокращений, условных обозначений 130
Список использованной литературы
