Введение
I. Общая характеристика работы 10
1.1. Актуальность проблемы 10
1.2. Цель и задача исследований 12
1.3. Научная новизна 13
1.4. Практическая значимость и внедрение результатов научных исследований в производство 13
1.5. Личный вклад соискателя 13
1.6. Апробация результатов работы 14
1.7. Публикации 15
1.8.Объем и структура и диссертации 15
1.9. Положения, выносимые на защиту 15
II. Обзор литературы 17
2.1 Роль фактора некроза опухоли альфа 17
2.2 Моноклональные антитела к ФНО-альфа в лечении ревматоидного артрита и других заболеваний 26
2.3 Современные тенденции в разработке технологий получения биофармацевтических препаратов 35
2.4 Этапы создания стабильной клеточной линии для экспрессии моноклональных антител 42
2.5 Основные аспекты оптимизации технологии культивирования 50
2.5.1 Температура культивирования 51
2.5.2 Величина pH 52
2.5.3 Концентрация растворенного кислорода 53
2.5.4 Осмолярность среды 55
2.5.5 Концентрация растворенного углекислого газа 56
2.5.6 Основные питательные вещества и метаболиты 57
2.5.7 Добавки, влияющие на продуктивность 60
2.5.8 Добавки, влияющие на гликозилирование 65
2.6 Режимы и аппаратурное оформление процессов культивирования клеток CHO для производства мАТ 69
III. Собственные исследования 79
3.1. Материалы и методы 79
3.2. Результаты исследований 99
3.2.1. Создание клеточной линии, стабильно продуцирующей моноклональное антитело адалимумаб 99
3.2.1.1. Дизайн экспрессионных конструкций 99
3.2.1.2. Отбор индивидуальных минипулов методом предельных разведений с последующей амплификацией и субклонированием 105
3.2.1.3. Отбор индивидуальных клонов методом предельных разведений общего амплифицированного пула 111
3.2.1.4. Выбор клона с максимальной продуктивностью 119
3.2.2. Оптимизация технологии культивирования клеточной линии СНО-продуцента мАТ Адалимумаб к фактору некроза опухолей альфа 127
3.2.2.1. Подбор питательной среды и подпитки, оптимальных для культивирования клонов продуцентов 127
3.2.2.2 Определение качественных характеристик мАТ адалимумаб, моделируемых на этапах культивирования 132
3.2.2.3 Исследование профиля гликозилирования биосимилярного и оригинального мАТ адалимумаб. 133
3.2.2.4 Оценка значимости различий в профиле гликозилирования биосимилярного и оригинального мАТ адалимумаб 136
3.2.2.5 Оптимизация профиля гликозилирования моноклонального антитела адалимумаб 138
3.2.3 Масштабирование технологии культивирования клеточной линии CHO-DHFR ADMB26 для производства моноклонального антитела адалимумаб 151
3.2.3.1 Подготовка инокулята 151
3.2.3.2 Сравнение эффективности культивирования в условиях механического и волнового перемешивания 153
3.2.3.3 Выбор температурного режима 155
3.2.3.4 Фильтрация и осветление культуральной жидкости, содержащей моноклональное антиело адалимумаб 158
3.2.4 Оценка биоподобия мАТ адалиумаб 161
3.2.4.1 Анализ профиля гликозилирования мАТ адалимумаб при культивировании в выбранных условиях 161
3.2.4.2 Оценка биологической активности биоподобного мАТ адалимумаб в сравнении с оригинальным 162
3.2.4.3 Оценка заряженных изоформ биосимилярного мАТ адалимумаб в сравнении с оригинальным 163
3.2.5 Технологическая схема процесса и материальный баланс 170
3.2.6 Экономическая эффективность процесса 174
IV. Обсуждение результатов 176
V. Заключение 187
5.1 Выводы 187
5.2 Практическое использование научных результатов 189
5.3 Рекомендации по использованию научных выводов 190
VI. Литература 191
