Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Тимозины и их свойства. Тимозин бета 4 9
1.2. Структура Тр4 10
1.3. Способы получения Тр4 10
1.4. Ацилирование белков in vivo 12
1.5. Биологическая активность Тр4
1.5.1. Кардиопротекторные свойства Тр4 14
1.5.2. тр4 стимулирует ангиогенез и неоваскуляризацию ишемизированного миокарда 16
1.5.3. Роль тр4 в развитии опухолей и метастазировании 17
1.5.4. Влияние тр4 на восстановление кожных покровов и рост волос 1.6. Обзор молекулярных механизмов, регулируемых активностью Тр4 19
1.7. Стратегия контролируемого высвобояедения вещества: способ доставки Тр4 к тканям 23
1.8. Сульфоксид ТР4 (TP4SO) 25
1.9. Активные аминокислотные фрагменты в составе молекулы Тр4 26
1.10. Применение Тр4 в клинике 29
2. Собственные исследования 30
2.1. Материалы и методы исследований 30
2.1.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения
рекомбинантного Тр4 человека до пилотного производства 30
2.1.1.1. Материалы 30
2.1.1.2. Приготовление буферных растворов 31
2.1.1.3. Выращивание инокулята штамма ER2566/ pERTEVrsTB4 для засева ферментёра 31
2.1.1.4. Культивирование штамма-продуцента ER2566/pERTEVrsTB4 в ферментёре 32
2.1.1.5. Разрушение биомассы 32
2.1.1.6. Подбор условий осаждения балластных белков из осветлённого клеточного лизата 33
2.1.1.7. Масштабирование процесса температурной обработки клеточного лизата 33
2.1.1.8. Хроматографическая очистка гибридного белка 33
2.1.1.9. Подготовка телец включения TEV-протеиназы
2.1.1.10. Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитического расщепления гибридного белка 34
2.1.1.11. Масштабирование реакции протеолитического расщепления гибридного белка 34
2.1.1.12. Хроматографическое разделение дезацетилтимозина бета 4 и остаточного белка 34
2.1.1.13. Определение условий ингибирования реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 .35
2.1.1.14. Масштабирование реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 и очистка продуктов реакции на ОФ ВЭЖХ 35
2.1.1.15. Аналитические методы контроля 35
2.1.2. Разработка способов получения аналогов Тр4 в виде конъюгатов, устойчивых к
деградации в токе крови 36
2.1.2.1. Материалы 36
2.1.2.2. Подбор условий проведения реакции ацилирования дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты 36
2.1.2.3. Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты 36
2.1.2.4. Очистка моногексаноилтимозина бета 4 37
2.1.2.5. Подбор условий проведения реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4 37
2.1.2.6. Масштабирование реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4 37 2.1.2.7. Очистка моносиалированного тр4 37
2.1.2.8. Подбор условий проведения реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4 38
2.1.2.9. Масштабирование реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4 2.1.2.10. Очистка моноПЭГилированного тр4 38
2.1.2.11. Определение структуры модифицированного тр4 38
2.1.2.12. Тестирование стабильности аналогов тр4 и химически синтезированного тр4 с использованием сыворотки крови 39
2.1.2.13. Аналитические методы контроля 39
2.1.3. Разработка интеин-опосредованного метода получения рекомбинантного Тр4 из
ацетилированного гибридного белка in vivo 40
2.1.3.1. Материалы 40
2.1.3.2. Приготовление питательных сред 41
2.1.3.3. Приготовление буферных растворов 41
2.1.3.4. Синтез олигонуклеотидов для клонирования 41
2.1.3.5. Создание рекомбинантной плазмиды pERb4-Gyr 42
2.1.3.6. Создание рекомбинантной плазмиды pERb4Gyr-RBS 43
2.1.3.7. Создание рекомбинантных плазмид pERb4GyrA-AcAla и pERb4GyrA-AcSer 43
2.1.3.8. Подбор условий ацетилирования in vivo 44
2.1.3.9. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента Е. coli C3030/pERb4GyrA-AcSer 2.1.3.10. Аффинная хроматография гибридного белка 45
2.1.3.11. ОФВЭЖХ 45
2.1.3.12. Аналитические методы контроля 45
2.1.3.13. Метод отбора клонов 46
2.1.3.14. Методы трансформации 46
2.1.4. Эффективность рекомбинантного Тр4 в спонтанной мышиной модели хронического
дерматита 47
2.1.4.1. Материалы 47
2.1.4.2. Определение эффективности рекомбинантного тр4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита 47
2.2. Результаты и обсуждение 48
2.2.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения
рекомбинантного Тр4 человека до пилотного производства 48
2.2.1.1. Масштабирование стадии культивирования штамма-продуцента и стадии разрушения клеточной биомассы 49
2.2.1.2. Осаждение балластных белков из осветлённого клеточного лизата 49
2.2.1.3. Оптимизация и масштабирование стадии анионообменной хроматографии гибридного белка.50
2.2.1.4. Оптимизация и масштабирование стадии протеолитического расщепления гибридного белка.51
2.2.1.5. Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4 52
2.2.1.6. Оптимизация и масштабирование стадии ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 54
2.2.2. Разработка способов получения аналогов Тр4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови 57
2.2.2.1. Ацилирование дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты 58
2.2.2.2. Сиалирование дезацетилтимозина бета 4 60
2.2.2.3. ПЭГилирование дезацетилтимозина бета 4 62
2.2.2.4. Определение структуры полученных аналогов ТР4 65
2.2.2.5. Определение стабильности полученных аналогов тр4 68
2.2.3. Разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантного Тр4
из ацетилированного гибирдного белка in vivo 69
2.2.3.1. Создание рекомбинантных плазмид pERb4GyrA-AcSer и pER - Tb4GyrA - AcAla 69
2.2.3.2. Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридного белка 70
2.2.3.3. Подбор условий ацетилирования in vivo 72
2.2.3.4. Протеолитический анализ последовательности тр4 76
2.2.4. Эффективность рекомбинантного Тр4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита 78
2.2.4.1. Влияние монотерапии препарата тр4 на проявление признаков дерматита 78
2.2.4.2. Отдаленные эффекты препарата тр4 на фоне дополнительной противомикробной и противогрибковой терапии 79
3. Выводы 81
4. Список литературы
