Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Роль лекарственных средств пептидной и белковой природы в современной фармакологии 14
1.1.1 Препараты инсулина 15
1.1.2 Препараты гормона роста 17
1.2 Методы исследования пептидов и белков 19
1.2.1 Спектрофотометрические методы 19
1.2.2 Хроматографические методы 20
1.2.3 Методы масс-спектрометрии
1.2.3.1 Определение молекулярной массы пептидов и белков 23
1.2.3.2 Идентификация пептидов и белков 25
1.3 Оценка подлинности лекарственных средств пептидной природы 37
Глава 2 Материалы и методы исследования 40
2.1 Материалы 40
2.2 Стандартные образцы 41
2.3 Исследуемые образцы 41
2.4 Вспомогательное оборудование и средства измерения 42
2.5 Приготовление рабочих и буферных растворов
2.5.1 Подготовка деионизованной воды 43
2.5.2 Приготовление реактива Бредфорда 44
2.5.3 Приготовление 5 % водного раствора муравьиной кислоты 44
2.5.4 Приготовление 0,1 % водного раствора гидроксида натрия 44
2.5.5 Приготовление денатурирующего буферного раствора 45
2.5.6 Приготовление раствора для восстановления дисульфидных связей 45
2.5.7 Приготовление раствора для модификации сульфгидрильных групп 46
2.5.8 Приготовление буферного раствора для проведения ферментативного расщепления 46
2.5.9 Приготовление раствора трипсина из свиной поджелудочной железы 47 2.5.10 Приготовление раствора эндопротеиназы Glu-C из Staphylococcus aureus V8 47
2.5.11 Приготовление раствора эндопротеиназы Asp-N из Pseudomonas fragi 47
2.5.12 Приготовление раствора эндопротеиназы Lys-C из Lysobacter enzymogenes 48
2.5.13 Приготовление раствора эндопротеиназы Arg-C из подчелюстной железы мыши 48
2.5.14 Приготовление растворов стандартных образцов 48
2.5.15 Приготовление растворов лизатов стандартных образцов 49
2.5.16 Приготовление растворов исследуемых образцов 50
2.5.17 Приготовление растворов лизатов исследуемых образцов 51
2.5.18 Приготовление подвижной фазы для высокоэффективной
жидкостной хроматографии 52
2.6 Техника эксперимента 53
2.6.1 Качественное определение наличия веществ пептидной природы по методике Бредфорда 53
2.6.2 Изучение влияния вспомогательных компонентов готовых форм лекарственных средств пептидной или белковой природы на полноту ферментативного расщепления 53
2.6.3 Условия хроматографического разделения 55
2.6.4 Условия спектрофотометрического детектирования 55
2.6.5 Условия масс-спектрометрического детектирования 56
2.6.6 Определение моноизотопной молекулярной массы действующего вещества лекарственного средства 57
2.6.7 Обработка результатов с использованием специализированного программного обеспечения 58
Глава 3 Результаты и обсуждение 59
3.1 Алгоритм установления подлинности лекарственных средств пептидной и белковой природы 59 3.2 Оценка наличия соединений пептидной или белковой природы спектрофотометрическим методом 63
3.3 Оценка подлинности действующего вещества лекарственного средства по соответствию теоретической и экспериментально установленной моноизотопных молекулярных масс 64
3.4 Оценка подлинности действующего вещества лекарственного средства по соответствию теоретической и экспериментально установленной аминокислотной последовательности
3.4.1 Изучение влияния вспомогательных компонентов готовых форм лекарственных средств пептидной или белковой природы на полноту ферментативного расщепления 66
3.4.2 Получение масс-спектров фрагментных ионов с использованием алгоритма интеллектуального управления измерениями 77
3.4.3 Обработка полученных результатов с использованием специализированного программного обеспечения 90
Глава 4. Апробация унифицированного способа установления подлинности лекарственных средств пептидной и белковой природы 100
4.1 Подлинные лекарственные средства 100
4.1.1 Препараты инсулина 100
4.1.2 Препараты рекомбинантного соматотропного гормона 107
4.2 Фальсифицированные лекарственные средства и субстанции 110
Выводы 120
Список использованных источников 122
