Введение
1. Обзор литературы. Протеазы как индукторы и медиаторы регулируемой клеточной смерти 11
1.1 Каспазы 11
1.2 Кальпаины 18
1.3 Гранзимы 21
1.4 Катепсины 25
1.5 Бактериальные протеазы 27
1.6 Вирусные протеазы 31
1.7 Заключение 35
2. Материалы и методы исследований 38
2.1 Реактивы и материалы 38
2.2 Линии клеток и бактериальные штаммы 38
2.3 Плазмиды и синтетические олигонуклеотиды 39
2.4 Общие методы 40
2.4.1 Манипуляции с нуклеиновыми кислотами 40
2.4.2 Создание плазмидных экспрессионных конструкций 41
2.4.3 Манипуляции с белками 44
2.4.4 Работа с бактериями и эукариотическими клетками 45
2.5 Получение антител, специфичных к протеазе 3С вируса гепатита А человека 47
2.6 Оценка цитотоксического действия 3Cpro в зависимости от уровня экспрессии ее гена 47
2.7 Исследование эффекта свидетеля, сопровождающего гибель клеток вследствие экспрессии 3Cpro 48
2.8 Обработка и анализ полученных данных 48
3. Результаты и обсуждение 49
3.1 Характеристика клеточной гибели, вызываемой протеазой 3С вируса гепатита А человека 49
3.1.1 Экспрессия и оценка цитотоксического действия 3Сpro с помощью системы Tet-Off 49
3.1.2 Экспрессирующие 3Cpro клетки характеризуются нарушением функционирования митохондрий 52
3.1.3 Гибель клеток, экспрессирующих 3Cpro, сопровождается конденсацией хроматина и не зависит от каспаз, кальпаинов и катепсинов является причиной пути 54
3.1.4 Вакуолизация и гибель экспрессирующих 3Cpro клеток происходит не по механизму некроптоза 54
3.1.5 Вакуоли экспрессирующих 3Cpro клеток имеют неописанные ранее характеристики 56
3.1.6 Разработка экспериментальной системы для конститутивной экспрессии 3Cpro и оценки цитотоксического действия фермента 58
3.1.7 Гибель клеток, трансфицированных конструкцией pCI-3C, сопровождается цитоплазматической вакуолизацией 60
3.1.8 Гибель трансфицированных конструкцией pCI-3C клеток не зависит от активности каспаз 61
3.1.9 Некростатин-1 не оказывает влияния на выживаемость клеток, трансфицированных конструкцией pCI-3C 62
3.1.10 Вызываемая 3Cpro клеточная гибель может быть отнесена к одному из четырех известных типов РКС 63
3.1.11 Гибнущие вследствие действия 3Cpro клетки приобретают некротическую морфологию 64
3.1.12 Индуцируемая 3Cpro клеточная гибель не является разновидностью партанатоса или MPT-ассоциированной РКС 66
3.1.13 Массовая деградация лизосом не гибели клеток при экспрессии 3Cpro 3Cpro гибель развивается 68
3.1.14 Индуцируемая ферроптоза 68
3.2 Характеристика эффекта свидетеля, сопровождающего гибель клеток при экспрессии протеазы 3С вируса гепатита А человека 71
3.2.1 Ассоциированный с экспрессией 3Cpro эффект свидетеля не зависит от межклеточных контактов и связан с действием цитотоксических факторов, находящихся в среде 71
3.2.2 Цитотоксическое действие факторов, обуславливающих эффект свидетеля при экспрессии 3Cpro, распространяется на клетки грызунов 73
3.2.3 Гибель трансфицированных конструкцией pCI-3C клеток и эффект свидетеля проявляются при одинаковом уровне экспрессии 3Сpro 74
3.2.4 Цитотоксические факторы, обуславливающие эффект свидетеля при экспрессии 3Cpro, индуцируют гибель клеток по пути ферроптоза 75
3.2.5 Цитотоксические факторы, обуславливающие гибель экспрессирующих 3Cpro клеток, имеют узкий диапазон молекулярной массы 77
3.3 Оценка перспектив использования комбинации 3Cpro и суицидальной системы FCU1/5-ФЦ для генной терапии онкологических заболеваний 79
3.3.1 Создание моно- и бицистронных конструкций, обеспечивающих индивидуальную и совместную экспрессию 3Cpro и FCU1 82
3.3.2 Клетки, экспрессирующие FCU1 бицистронных конструкций, чувствительность к 5-ФЦ 84
3.3.3 Совместная экспрессия 3Cpro и суммированию цитотоксических ферментов 88
3.4 Заключение 90
Выводы 91
Благодарности 92
Список сокращений 94
Список литературы 94
