Введение
1. G4 в геномном контексте (обзор литературы) 14
1.1. Общая характеристика G4 структур и методов их исследования 15
1.2. G4 в геноме: условия формирования и особенности локализации 23
1.3. Проблемы формализации и программные инструменты поиска G4 30
2. G-квадруплексы в дизайне аптамеров и супрамолекулярных ДНК структур (обсуждение результатов) 43
2.1. Неканонические “в квадрате” ДНК-структуры (ImGQ) 43
2.1.1. Примеры ImGQ и оценка их термической стабильности при физиологических условиях 45
2.1.2. Динамика ImGQ ядра 52
2.1.3. Взаимодействие ImGQ c низкомолекулярными лигандами 57
2.1.4. Взаимодействие ImGQ c белками 62
2.2. Инструмент поиска ImGQ-мотивов в геномах (ImGQfinder) 70
2.2.1. Возможности ImGQfinder 70
2.2.2. Анализ распределения ImGQ-мотивов в геноме человека 71
2.3. Новые противовирусные аптамеры на основе геномного G4 80
2.3.1. Дизайн на основе G4 скаффолда как альтернатива de novo селекции аптамеров 80
2.3.2. Выбор скаффолдов для аптамеров к белкам ВИЧ-1 и их модификация 82
2.3.3. Проверка противовирусной активности и цитотоксичности аптамеров 87
2.3.4. Проверка гипотезы взаимодействия аптамеров с поверхностными гликопротеинами ВИЧ 90
2.4. Химическая модификация известного G4 аптамера 93
2.4.1. Обзор модификаций, предложенных для оптимизации тромбин-связывающего аптамера TBA15 93
2.4.2. Синтетический базис для оптимизации ТВА (на примере триазольной межнуклеотидной модификации) 95
2.4.3. Оценка влияния модификации на аффинность аптамера к мишени, термическую стабильность, устойчивость к нуклеазному гидролизу и активность 100
2.4.4. Сравнительный анализ эффектов различных химических модификаций TBA и введения дополнительных структурных модулей. 103
2.5. Ассоциаты природных и модифицированных G4 107
2.5.1. G4 мотивы Алу-повторов: общая характеристика 108
2.5.2. Самоассоциация Алу-G4 110
2.5.3. G4 микросателлитов и их модифицированные аналоги: общая характеристика 114
2.5.4. Влияние петель G4 и внешних условий на выход супрамолекулярных структур 124
2.5.5. ДНК-конструкции на основе интеркалированных параллельных дуплексов (i-мотивов) 128
3. Экспериментальная часть 136
3.1. Синтез, очистка и MS-анализ олигонуклеотидов 136
3.2. Синтез фосфорамидита динуклеозидного аналога для триазольной модификации ОДН 137
3.2.1. Реагенты, растворители; ЯМР и ES-MS-анализ нуклеозидных аналогов 137
3.2.2. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -метилентимидин (2) 138
3.2.3. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -(гидроксиметил)тимидин (3) 139
3.2.4. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -формилтимидин (4) 140
3.2.5. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -(2,2-дибромоэтинил)тимидин (5) 141
3.2.6. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -этинилтимидин (6) 141
3.2.7. 4-[3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокситимиди-5-ил]-1-[3 -дезокси-5 -О-(4,4 -диметокситритил)тимидин-3-ил]-1H-1,2,3-триазол (7) 142
3.2.8. 1-[3 -Дезокси-5 -О-(4,4 -диметокситритил)тимидин-3-ил]-4-[5 -дезокситимиди-5-ил] -1H-1,2,3-триазол (8) 144
3.2.8. 4-{3 -[(2-цианоэтокси)диизопропиламинофосфанилокси]-5 дезокситимидин-5 -ил}-1-[3 -дезокси-5 -О-(4,4 -диметокситритил)тимидин-3-ил] 1H-1,2,3-триазол (9) 145
3.3. Установление вторичной структуры олигонуклеотидов 146
3.3.1. Приготовление образцов 146
3.3.2. Абсорбционная спектроскопия и спектроскопия КД 146
3.3.3. Флуориметрия 147
3.3.4. ЯМР-спектроскопия 148
3.3.5. Атомно-силовая микроскопия 149
3.3.6. Гель-фильтрационная хроматография 149
3.3.7. Молекулярное моделирование 150
3.4. Исследование G4-белковых взаимодействий 152
3.4.1. Торможение в геле 152
3.4.2. Анализ поляризации флуоресценции 153
3.4.3. Микротермофоретический анализ 154
3.4.4. PCSW-анализ 154
3.4.5. Скрининг с использованием белковых чипов 155
3.5. Оценка активности, цитотоксичности и скорости ферментативной деградации G4 аптамеров 158
3.5.1. Ингибиторная активность аптамеров к тромбину (тест на тромбиновое время) 158
3.5.2. Ингибиторная активность аптамеров к ВИЧ-1 (эксперименты по трансдукции клеток псевдовирусом) 158
3.5.3. Цитотоксичность аптамеров (MTT-тест и FACS-анализ) 159
3.5.4. Нуклеазный гидролиз 160
3.6. Биоинформатический анализ 160
3.6.1. Представленность и локализация ImGQ мотивов в геноме человека 160
3.6.2. Функциональный анализ генов, обогащенных ImGQ мотивами в приграничных участках интронов . 161
4. Заключение 163
5. Выводы 165
6. Литература 166
Благодарности 200
