Введение
Часть I. Обзор литературы 10
Глава 1. Структура и функция ацетилхолиновых рецепторов 10
1.1. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR) 10
1.1.1. Субъединичная организация nAChR 11
1.1.2. Пространственная структура nAChR 14
1.1.3. Механизм передачи сигнала через nAChR 16
1.1.4. Передача сигнала в нейромышечном синапсе 19
1.1.5. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы в ЦНС 20
1.1.6. nAChR и нейродегенерация 23
1.1.7. Не-нейрональная холинергическая сигнальная система 24
1.1.8. Холинергические механизмы в иммунной системе 26
1.1.9. Холинергическая система легких 27
1.1.10. Холинэргическая регуляция в клетках эпителия 28
1.1.11. Роль nAChR в развитии злокачественных опухолей 30
1.2. Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы (mAChR) 32
1.2.1. Трансдукция сигнала в рецепторах GPCR 32
1.2.2. Пространственная структура mAChR 35
1.2.3. Лиганды мускариновых рецепторов 36
Глава 2. Трехпетельные белки семейства Ly6/Upar 39
2.1. Токсины из яда змей 41
2.2. Нейромодуляторы насекомых 46
2.3. Трехпетельные белки рыб и земноводных 47
2.4. Трехпетельные белки млекопитающих 49
Глава 3. Материалы и методы 60
3.1. Материалы 60
3.1.1. Реактивы 60
3.1.2. Бактериальные и эукариотические клеточные линии 61
3.1.3. Плазмидные векторы 61
3.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур 62
3.1.5. Питательные среды для роста эукариотических клеточных линий 62
3.1.6. Антитела 63
3.1.7. Синтетические олигонуклеотиды 64
3.2. Методы 68
3.2.1. Препараты рекомбинантных белков 68
3.2.2. Эксперименты с модельными животными 75
3.2.2.1. Модельные животные 75
3.2.2.2. Доставка ws-Lynx1 в мозг 76
3.2.2.3. Поведенческие тесты 77
3.2.2.4. Иммуногистохимия и окрашивание тиофлавином S 79
3.2.2.5. Определение токсичности рекомбинантных токсинов 80
3.2.3. Электрофизиология 80
3.2.3.1. Электрофизиологические эксперименты в срезах коры головного мозга 80
3.2.3.2. Долговременная потенциация в CA1 срезов гиппокампа 81
3.2.3.3. Электрофизиологические эксперименты в ооцитах X. laevis 82
3.2.4. Исследование взаимодействия трехпетельных белков с рецепторами 84
3.2.4.1. Аффинная экстракция 84
3.2.4.2. Связывание с mAChR 86
3.2.4.3. Взаимодействие белков с nAChR из Torpedo californica 87
3.2.4.4. Конкуренция с 125I--Bgtx за связывание с 7-nAChR 88
3.2.5. Вестерн-блоттинг 88
3.2.6. Полимеразная цепная реакция 89
3.2.7. Эксперименты с модельными клеточными линиями 89
3.2.7.1. Культивирование эукариотических клеток 89
3.2.7.2. Культивирование клеток РС12 и анализ фосфорилирования ERK1/2 MAP-киназы 3.2.7.3. Анализ пролиферативной активности 92
3.2.7.4. Остановка клеточного цикла в клетках A549 93
3.2.7.5. Нокдаун гена 7-nAChR 93
3.2.7.6. Анализ фосфорилирования киназ под действием SLURP-1 и ws-Lynx1 94
3.2.7.7. Проточная цитометрия 95
3.2.8. ПЦР в реальном времени 95
3.2.9. Конфокальная микроскопия 96
3.2.10. Определение пространственной структуры и динамических характеристик с помощью ЯМР-спектроскопии 97
3.2.11. Компьютерное моделирование структуры комплексов 98
3.2.12. Статистическая обработка результатов экспериментов 100
Глава 4. Результаты и обсуждение 101
4.1. Рекомбинантная продукция трехпетельных белков 101
4.1.1. Продукция нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana в составе слитного белка с тиоредоксином 101
4.1.2. Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II 105
4.1.3. Бактериальная продукция и ренатурация из телец включения трехпетельных белков человека и токсина WTX 107
4.1.4. Сравнение эффективности ренатурации различных трехпетельных белков 108
4.2. Структурные детерминанты, важные для взаимодействия трехпетельных нейротоксинов с мишенями 114
4.2.1. Мембранотропный сайт нейротоксина II из яда Naja oxiana 114
4.2.1.1. Нейротоксин II из Naja oxiana связывается с липосомами, имитирующими мембранное окружение nAChR 114
4.2.1.2. Сайт связывания с мембраной расположен в «голове» нейротоксина II 115
4.2.1.3. Компьютерное моделирование предсказывает топологию взаимодействия NTII с мембраной 116
4.2.1.4. Мутации в области «головы» нейротоксина II приводят к исчезновению специфического взаимодействия токсин/мембрана 117
4.2.2. Роль центральной петли нейротоксинов во взаимодействии с рецепторами мишенями 118
4.2.2.1. Роль центральной петли длинных -нейротоксинов во взаимодействии с нейрональными nAChR 118
4.2.2.2. Центральная петля длинных -нейротоксинов важна для взаимодействия с ГАМКA-рецепторами 123
4.2.2.3. Подвижная центральная петля – важная структурная детерминанта взаимодействия «слабого» токсина WTX с nAChR и mAChR 125
4.2.2.3.1. Взаимодействие рекомбинантного аналога «слабого» токсина WTX с мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами 125
4.2.2.3.2. Пространственная структура и конформационная гетерогенность «слабого» токсина 129
4.2.2.3.3. Компьютерное моделирование взаимодействия rWTX[P33A] с M1 и M3 mAChR 131
4.2.2.3.2. Взаимодействие «слабого» токсина с nAChR 138
4.3. Трехпетельные нейромодуляторы Lynx1 и Lypd6 147
4.3.1. Структурно-функциональные исследования Lynx1 147
4.3.1.1. Экспрессия Lynx1 в мозге крыс 147
4.3.1.2. Пространственная структура водорастворимого домена белка человека Lynx1 150
4.3.1.3. Взаимодействие ws-Lynx1 с ацетилхолинсвязывающими белками, nAChR и mAChR 152
4.3.1.4. Влияние ws-Lynx1 на ACh-индуцированные токи через nAChR человека, экспрессированные в ооцитах Xenopus laevis 155
4.3.1.5. Определение активного сайта в молекуле ws-Lynx1 157
4.3.1.6. Ws-Lynx1 уменьшает никотин-индуцированное фосфорилирование ERK1/2 МАР киназ в клетках линии РС12 и срезах полосатого тела 161
4.3.1.7. Lynx1 экстрагирует различные субъединицы nAChR из мозга крысы и человека и конкурирует с амилоидным пептидом A(1-42) за связывание с nAChR 163
4.3.1.8. Ws-Lynx1 предотвращает A1-42-индуцированную цитотоксичность in vitro 166
4.3.1.9. A1-42 снижает экспрессию Lynx1 в нейронах коры 166
4.3.1.10. Ws-Lynx1 предотвращает нарушение долговременной потенциации, вызванное A1-42 168
4.3.2. Влияние ws-Lynx1 на когнитивные процессы in vivo 170
4.3.2.1. Ws-Lynx1 способен проникать через гематоэнцефалический барьер 170
4.3.2.2. Ws-Lynx1 компенсирует нарушение моторного обучения, вызванное MLA 171
4.3.2.3. Ws-Lynx1 компенсирует вызванное MLA нарушение обонятельной памяти 174
4.3.2.4. Ws-Lynx1 усиливает ACh-индуцированные токи в 7-nAChR в коре головного мозга крысы 174
4.3.2.5. Ws-Lynx1 усиливает долговременную потенциацию и предотвращает блокаду ДВП, вызванную MLA 176
4.3.2.6. Ws-Lynx1 конкурирует с MLA за связывание с 7-nAChR 178
4.3.2.7. Ws-Lynx1 компенсирует нарушения когнитивных функций и усиливает ДВП у 2xTg-AD мышей 179
4.3.2.8. Ws-Lynx1 увеличивает синаптическую плотность в гиппокампе мышей 2xTg-AD 183
4.3.3. Структурно-функциональные исследования водорастворимого домена белка человека Lypd6 185
4.3.3.1. rLypd6 ингибирует ACh-индуцированные токи в 7-nAChR, экспрессированных в ооцитах X. laevis 185
4.3.3.2. Со-локализация Lypd6 с 7-nAChR в нейронах коры и гиппокампа 186
4.3.3.3. rLypd6 ингибирует токи через 7-nAChR, вызванные холином, на срезах гиппокампа мыши 187
4.3.3.4. rLypd6 подавляет долговременную потенциацию в гиппокампе 188
4.3.3.5. Пространственная структура и динамика rLypd6 в растворе 189
4.3.3.6. Компьютерное моделирование комплекса rLyp6 c 7-nAChR 192
4.4. Не-нейрональные эндогенные трехпетельные белки SLURP-1, SLURP-2 и Lynx1 196
4.4.1. Структурно-функциональные исследования rSLURP-1 196
4.4.1.1. rSLURP-1 снижает пролиферацию кератиноцитов, взаимодействуя с 7-nAChR 196
4.4.1.2. rSLURP-1 селективно связывается с 7 субъединицами nAChR, экстрагированными из коры головного мозга человека 198
4.4.1.3. rSLURP-1 взаимодействует с 7-nAChR вне ортостерического сайта связывания 199
4.4.1.4. Пространственная структура и динамика rSLURP-1 202
4.4.2. Структурно-функциональные исследования rSLURP-2 205
4.4.2.1. rSLURP-2 может взаимодействовать с различными подтипами nAChR 205
4.4.2.3. Электрофизиологические исследования взаимодействия rSLURP-2 с nAChR
человека 206
4.4.2.4. rSLURP-2 ингибирует никотин-индуцированное фосфорилирование ERK1/2 MAP киназ 209
4.4.2.5. rSLURP-2 влияет на рост кератиноцитов, взаимодействуя с различными типами ацетилхолиновых рецепторов 210
4.4.2.6. rSLURP-2 является аллостерическим модулятором М1 и М3 mAChR 212
4.4.2.6. Пространственная структура и динамика rSLURP-2 214
4.4.2.7. Компьютерное моделирование взаимодействия rSLURP-2 с 7- and 32-nAChR 217
4.4.3. rSLURP-1 и rSLURP-2 контролируют рост эпителиальных раковых клеток, взаимодействуя с nAChR 221
4.4.3.1. rSLURP-1 и rSLURP-2 SLURP-1 и SLURP-2 тормозят рост клеток раковых линий эпителиального происхождения 222
4.4.3.2. 7-nAChR – мишень действия rSLURP-1 в клетках карцином 224
4.4.3.3. Белки SLURP ингибируют рост клеток A431 и А549 посредством активации различных поверхностных рецепторов 227
4.4.3.4. rSLURP-1 ингибирует рост эпителиальных клеток по метаботропному механизму 231
4.4.3.5. Антипролиферативный эффект rSLURP-1 в различных клетках связан с активацией разных сигнальных внутриклеточных путей, но всегда с участием IP3 рецепторов 232
4.4.3.6. rSLURP-1 в клетках А431вызывает фосфорилирование киназ и транскрипционных факторов, контролирующих пролиферацию 234
4.4.3.7. rSLURP-1 уменьшает экспрессию 7-nAChR и индуцирует секрецию эндогенного SLURP-1 в клетках А431 237
4.4.4. Ws-Lynx1, взаимодействуя с 7-nAChR, индуцирует арест клеточного цикла и апоптоз в клетках аденокарциномы легкого 241
4.4.4.1. Экспрессия генов Lynx1 и nAChR в не-нейрональных клетках человека 241
4.4.4.2. Lynx1 со-локализован с 7-nAChR в эпителиальных клетках 243
4.4.4.3. Ws-Lynx1 снижает жизнеспособность клеток рака легкого и подавляет стимуляцию роста клеток, вызванную никотином 244
4.4.4.4. Ws-Lynx1 вызывает арест клеточного цикла в клетках А549 246
4.4.4.5. Ws-Lynx1 контролирует рост клеток A549, модулируя 7-nAChR, активацию сигнального пути PKC/IP3 и других сигнальных каскадов 248
4.4.4.6. Ws-Lynx1 регулирует фосфорилирование киназ и транскрипционных факторов, контролирующих клеточный рост 250
4.4.4.7. Ws-Lynx1 индуцирует апоптоз в клетках A549 через фосфорилирование про-апоптотического фактора p53 253
Заключение 256
Выводы 261
Благодарности 262
Список использованной литературы 264
