Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Механизмы регуляции объема клеток 12
2.1.1. Факторы, определяющие клеточный объем в стационарных условиях 12
2.1.2. Нестационарные изменения и механизмы ауторегуляции объема клеток 13
2.1.2.1 Мембранные транспортеры, участвующие в RVD 16
2.1.2.2. Мембранные транспортеры, участвующие в RVI 19
2.1.3 Физико-химические сигналы, генерирующиеся при изменении клеточного объема и природа объемного сенсора 20
2.1.3.1 Ионная сила 20
2.1.3.2 Внутриклеточная концентрация хлора ([СГ]І) 21
2.1.3.3 Выброс АТФ
2.1.3.4. Натяжение плазматической мембраны 23
2.1.3.5. Трехмерный цитоскелет 28
2.1.3.6. Двумерный цитоскелет (мембранный каркас) и полифосфоинозитиды 29
2.1.3.7. Концентрация макромолекул: цитоплазма как биогелъ 32
2.1.4. Внутриклеточная сигнализация, связанная с изменением объема клеток 34
2.2. Физиологическое и патофизиологическое значение изменения
объема клеток 35
2.2.1. Изменение объема клеток при действии гормонов и нейротрансмиттеров 36
2.2.1.1. Пуринэргические рецепторы как регуляторы ионного транспорта 39
2.2.2. Изменение объема клеток при действии факторов, приводящих к гибели клеток 43
2.2.2.1 Изменение клеточного объёма как подход для классификации клеточной смерти 44
2.2.2.2 Термодинамическая модель вовлечения мембранных транспортеров в изменения клеточного объёма
2.2.2.3. Изменения объёма, запускаемые стимулами клеточной смерти 49
2.2.2.4. Является ли сжатие достаточным стимулом для смерти клеток? 51
2.2.2.5. Является ли набухание достаточным стимулом для смерти клеток? 58
2.3. Методы, используемые для измерения объема клеток:
преимущества и недостатки 59
3. Материалы и методы 67
3.1. Гладкомышечные клетки 67
3.2. Клетки C11-MDCK 67 3.3. Измерения клеточного объёма 68
3.4. Внутриклеточная концентрация Са ([Са ]І) 76
3.5. Внутриклеточный состав моновалентных ионов 77
3.6. Тест на образование фрагментов хроматина 78
3.7. Активность каспазы-3 78
3.8. Выброс цитохрома С 79
3.9. Высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH) 3.10. Определение количества клеток, прикрепленных к подложке 80
3.11. Измерение содержания белка модифицированным методом Лоури 81
3.12. Измерение содержания белка методом Бредфорда 81
3.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 82
3.14. Вестерн-блот 82
Реактивы 83
Статистическая обработка результатов 83
4. Результаты 85
4.1. Изменения клеточного объёма, вызванные ингибированием Na -АТФазы и смерть C11-MDCK клеток 85
4.1.1 Действия у абаина и безкалиевой среды на внутриклеточный состав катионов и жизнеспособность клеток 86
4.1.2 Воздействие уабаина и безкалиевой среды на объём клеток 90
4.1.3. Клеточный объём и освобождение LDH в гипотонической среде 92
4.1.4. Изменения клеточного объёма, вызванные пермеабилизацией плазматической мембраны 94
4.2. Изменение объема гладкомышечных клеток сосудов при
действии индукторов апоптоза 97
4.2.1. Динамика апоптоза в E1A-VSMC: ингибирование уабаином и форсколином 97
4.2.2. Кинетика модуляций объёма в голодающих по сыворотке E1A-VSMC 99
4.2.3. Кинетика модуляций объёма E1A-VSMC клеток при действии стауроспорина 101
4.2.4. Действие анизосмотической среды 103 4.3. Пуринэргическая регуляция объема интеркалированных
клеток эпителия почечных канальцев 106
4.3.1 Эффекты АТФ, УТФ и анизосмотической среды на клеточный объём С11 MDCK клеток 106
4.3.2 Роль Са +г и протеинкиназы А и С 109
4.3.3 Эффект антагонистов P2Yрецепторов 113
4.3.4 Эффект ингибиторов ионного транспорта на АТФ-зависимые изменения клеточного объёма 114
4.3.5 Действие А ТФ на внутриклеточный состав моновалентных ионов 118
4.3.6. Карибдотоксин и NPPB подавляют А ТФ-индуцированную экспрессию c-Fos 119
5. Обсуждение результатов 121
5.1 Смерть C11-MDCK клеток при действии уабаина не опосредуется набуханием и разрывом плазматической мембраны 121
5.2 Набухание, а не сжатие предшествует смерти гладкомышечных клетках сосудов, вызванной устранением ростовых факторов 125
5.3 Роль уменьшения объема в регуляции функционирования интерстициальных клеток эпителия почечных канальцев пуринэргическими рецепторами 1 5.3.1. Сильное и продолжительное сжатие С11-MDCK клеток при действии АТФ/УТФ 131
5.3.2. Клеточный механизм, служащий связывающим звеном при АТФ-индуцируемом клеточном сжатии 133
5.3.3. Физиологические значения АТФ-индуцированных изменений клеточного
объёма 136
7.Выводы 140
8. Список литературы
