Введение
ГЛАВА I. а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 10
1. Природные галактозосодержащие соединения 10
1.1 Галактоолигосахариды 10
1.2 Галактоманнаны, галактоглюкоманнаны 11
2. ос-Галактозидазы 14
2.1 Продуценты а-галактозидаз 14
2.2 Гликозил-гидролазные семьи а-галактозидаз 17
2.3 Биохимические свойства а-галактозидаз 17
2.4 Каталитические свойства а-галактозидаз 20
3. Применение а-галактозидаз 25
3.1 Кормовая промышленность 25
3.2 Пищевая промышленность 25
3.3 Целлюлозно-бумажная и текстильная промышленность 26
ГЛАВА II. ПЕКТИНЛИАЗЫ 27
1. Пектин 27
1.1 Основная цепь молекулы пектина 27
1.2 Боковые цепи молекулы пектина 29
1.3 Неуглеводные заместители в молекуле пектина 29
2. Пектин- и пектатлиазы 31
2.1 Структурная характеристика пектин- и пектатлиаз 33
2.2 Каталитические свойства пектин- и пектатлиаз 35
3. Применение пектина и пектинлиаз 37
3.1 Пищевая промышленность 37
3.2 Кормовая промышленность 39
3.3 Текстильная и целлюлозно-бумажная промышленность 39
ГЛАВА III. ФИТАЗЫ 41
1. Фитиевая кислота и её соли 41
1.1 Строение фитиевой кислоты 41
1.2 Содержание лшо-инозит фосфатов в растительном сырье 41
1.3 Физико-химические методы определения содержания фитиевой кислоты в образцах 43
2. Фитазы 44
2.1 Продуценты фитаз 44
2.2 Классификация фитаз 46
2.3 Биохимические свойства фитаз 50
2.4 Каталитические свойства фитаз 53
3. Применение фитаз^ 58
3.1 Кормовая промышленность 58
3.2 Пищевая промышленность 61
3.3 Медицина 62
ГЛАВА IV. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ PENICILLIUM CANESCENS КАК ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ 63
ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 66
ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 66
1. Использованные вещества 66
1.1 Ферментные препараты 66
1.2 Субстраты 66
1.3 Прочие реактивы 61
1.4 Хроматографические сорбенты 68
2. Методы 69
2.1. Выделение и очистка индивидуальных ферментов P.canescens 69
2.2 Определение концентрации белка 71
2.3 Определение биохимических характеристик ферментов 71
2.4 Методы определения активности ферментов 71
2.4.1 Определение активности по полисахаридным субстратам 71
2.4.2 Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров 72
2.4.3 Определение пектинлиазной активности 73
2.4.4 Определение фитазной и фосфатазной активности 75
2.5 Определение температурного и рН-оптимума действия ферментов 76
2.6 Изучение термо- и рН-стабильности ферментов 77
2.7 Определение кинетических параметров действия ферментов (Кт, V , К) 77
2.8 Исчерпывающий гидролиз специфических субстратов 78
2.9 Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) продуктов
гидролиза фитата Na 78
2.10 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза ГМ и галактоолигосахаридов 79
2.11 Изучение влияния эффекторов на активность ферментов 79
2.12 Изучении влияния соков желудочно-кишечного тракта свиней на свойства фитазы 80
2.13 Прикладные испытания ферментов 80
2.13.1 Оценка способности пектинлиазы осветлять яблочный сок 80
2.13.2 Изучение способности пектинлиазы увеличивать выход сока из ягод 81
2.13.3 Конверсия вторичного продукта переработки сои а-галактозидазами 81
2.13.4 Оценка способности ферментов увеличивать питательную ценность кормов iv vitro
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 83
ГЛАВА VI. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТО-ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ НА ОСНОВЕ НОВЫХ ШТАММОВ P.canescens 83
1. Создание новых конструкций на основе штаммов P.canescens 83
2. Характеристика ферментных препаратов, полученных с помощью штаммов
P.canescens, несущих гены гомологичных а-галактозидаз, пектинлиазы
и фитазы 86
ГЛАВА VII. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ сс-ГАЛАКТО-ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ P.canescens 88
1. Выделение гомогенных ферментов 88
2. Свойства гомогенных ферментов 93
2.1 сс-Галактозидазы А и С 94
2.1.1 Субстратная специфичность и классификация 94
2.1.2 рН- и температурные оптимумы активности 98
2.1.3 Стабильность 100
2.1.4 Устойчивость к «термошоку» 102
2.1.5 Кинетические характеристики 104
2.1.6 Влияние эффекторов на активность 1 Об
2.2 Пектинлиаза А 107
2.2.1 Субстратная специфичность 107
2.2.2 рН- и температурные оптимумы активности 109
2.2.3 Стабильность НО
2.2.4 Устойчивость к «термошоку» 110
2.2.5 Кинетические характеристики 112
2.2.6 Влияние эффекторов на активность 112 2.3ФитазаА 114
2.3.1 Субстратная специфичность 114
2.3.2 рН- и температурные оптимумы активности 116
2.3.3 Стабильность 119
2.3.4 Устойчивость к «термошоку» 121
2.3.5 Кинетические характеристики 122
2.3.6 Влияние эффекторов на активность 122
ГЛАВА VIII. ПРИКЛАДНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ФЕРМЕНТОВ 129
1. Оценка эффективности применения ферментного препарата рекомбинантной
Пел А P. canescens в процессах получения соков 129
1.1 Получение сока из клюквы 129
1.2 Осветление яблочного сока 131
2. Гидролиз вторичного продукта переработки сои ферментным препаратом рекомбинантной а-Гал С P.canescens 132
3. Оценка способности ферментов P.canescens повышать питательную ценность кормов in vitro 135
ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
ПРИЛОЖЕНИЕ
