Список сокращений...................................................................................................... 5
Введение ........................................................................................................................ 11
1. Обзор литературы................................................................................................. 15
1.1. Теломеры ............................................................................................................ 15
1.2. Теломеразный комплекс ................................................................................. 21
1.2.1. Основные сведения..................................................................................... 21
1.2.2. Обратная транскриптаза теломеразы .................................................... 22
1.2.3. Каталитический цикл теломеразы ......................................................... 24
1.2.4. Теломеразная РНК, ее структура и биогенез ........................................ 27
1.3. Альтернативные функции теломеразы........................................................ 35
1.3.1. Альтернативные функции обратной транскриптазы hTERT........... 36
1.3.1.1. TERT и Wnt-сигналинг........................................................................... 37
1.3.1.2. TERT и NF-κB сигналинг....................................................................... 38
1.3.1.3. TERT и MYC............................................................................................. 39
1.3.1.4. Другие альтернативные функции TERT............................................ 39
1.3.2. Альтернативные функции теломеразной РНК .................................... 40
1.3.2.1. Кодирующая функция теломеразной РНК......................................... 41
1.4. Аутофагия........................................................................................................... 42
1.4.1. Общие сведения........................................................................................... 42
1.4.2. Процесс аутофагии ..................................................................................... 44
1.4.3. Регуляция аутофагии ................................................................................. 46
1.4.3.1. Роль mTOR в регуляции аутофагии .................................................... 47
1.4.3.2. Роль AMPK в регуляции аутофагии.................................................... 51
1.4.4. Теломераза и аутофагия ............................................................................ 54
3
2. Результаты и обсуждение .................................................................................... 56
2.1. Создание клеточной линии с белком hTERP тегированным HiBiT....... 56
2.2. Влияние делеции нуклеотидов 184-188 в hTR на функционирование
теломеразы ................................................................................................................ 61
2.2.1. Делеция нуклеотидов 184-188 в hTR не влияет на активность
теломеразы ............................................................................................................. 62
2.2.2. Делеция нуклеотидов 184-188 в hTR не влияет на экспрессию hTERT
................................................................................................................................... 63
2.2.3. Делеция нуклеотидов 184-188 в hTR не влияет на локализацию
hTERT...................................................................................................................... 63
2.3. Участие белка hTERP в процессе аутофагии.............................................. 66
2.4. Выявление сигнального каскада, в регуляции которого участвует белок
hTERP......................................................................................................................... 71
2.5. Предполагаемый механизм действия hTERP в передаче сигналов
AMPK-mTORC1 ....................................................................................................... 79
3. Материалы и методы ........................................................................................... 81
3.1. Клеточные культуры ....................................................................................... 81
3.2. Среды для культивирования E.coli............................................................... 81
3.3. Приготовление компетентных клеток E.coli............................................... 81
3.4. Трансформация плазмидной ДНК в компетентные клетки E.coli ......... 82
3.5. Получение плазмиды GFP-HiBiT .................................................................. 83
3.5.1. Линеаризация вектора............................................................................... 83
3.5.2. Получение HiBiT-вставки......................................................................... 84
3.5.3. Лигирование ................................................................................................ 85
3.6. Получение лентивирусных частиц для создания линии HEK293T-GFPHiBiT ........................................................................................................................... 86
4
3.7. Трансдукция....................................................................................................... 88
3.8. Метод CRIPR/Cas9 для создания клеточной линии, с белком hTERP
тегированным HiBiT ............................................................................................... 88
3.9. Выделение геномной ДНК............................................................................... 89
3.10. ПЦР .................................................................................................................... 90
3.11. Протокол детекции HiBiT-тегированных белков в клеточных лизатах
...................................................................................................................................... 91
3.12. Протокол детекции HiBiT-тегированных белков методом блоттинга 92
3.13. Метод TRAP (протокол амплификации теломерных повторов) .......... 94
3.14. Создание клеточных линий, с оверэкспрессий белка hTERP................ 94
3.15. Трансфекция .................................................................................................... 95
3.16. Иммуноблотинг ............................................................................................... 96
3.16.1. Перечень использованных первичных антител................................. 97
3.16.2. Перечень использованных вторичных антител................................. 97
3.17. Обработка клеток............................................................................................ 97
3.18. Цитохимия........................................................................................................ 98
3.19. Статистический анализ ................................................................................. 98
4. Заключение............................................................................................................... 99
Выводы........................................................................................................................ 100
Благодарности............................................................................................................ 101
Список литературы................................................................................................... 102
