Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Полициклические ароматические углеводороды как загрязнители окружающей среды 13
1.2. Деградация пау в окружающей среде 16
1.2.1. Биохимические пути деградации нафталина микроорганизмами 17
1.2.2. Биохимические пути деградации фенантрена микроорганизмами 18
1.3. Бактериальные генетические системы биодеградации ПАУ 20
1.3.1. Гены катаболизма ПАУ грамотрицательных бактерий 20
1.3.2. Гены катаболизма ПАУ грамположительных бактерий 23
1.4. Плазмиды биодеградации. характеристика систем репликации, наследования и переноса известных плазмид INCP-9 группы 23
1.5. Конъюгационныи перенос катаболических плазмид в модельных системах 29
1.5.1. Системы для изучения переноса катаболических плазмид и генов 29
1.5.1.1. Исследование горизонтального переноса катаболических плазмид в
почве 29
1.5.1.2. Перенос катаболических плазмид в жидких и полужидких средах 38
1.5.1.3. Исследование горизонтального переноса катаболических плазмид в присутствии растений 40
1.5.2. Подходы к мониторингу бактериальных штаммов (доноров, реципиентов и трансконъюгантов) и переноса катаболических плазмид 41
1.5.2.1. Морфология колоний бактерий, ауксотрофность, репортерные гены флюоресценции и люминесценции 41
1.5.2.2. Использование индикаторных агаризованных сред 42
1.5.2.3. Антибиотикорезистентность 42
1.5.2.4. Визуализация плазмид, ПЦР и гибридизация 44
1.5.2.5. Мониторинг переноса плазмид с использованием селективных катаболических признаков 45
1.5.2.6. Косвенный мониторинг переноса катаболических плазмид 46
1.5.3. Влияние различных факторов на перенос катаболических плазмид и деградацию поллютантов 47
1.5.3.1. Наличие селективного давления 47
1.5.3.2. Влияние типа почвы на перенос плазмид 49
1.5.3.3. Наличие питательных веществ 51
1.5.3.4. «Горячие пятна» переноса плазмид (участки с благоприятствующими 52 плазмидному переносу условиями)
1.5.3.5. Эффект влажности при горизонтальном переносе катаболических плазмид 53
1.5.3.6. Температура как один из факторов, влияющих на плазмидный перенос 54
1.5.3.7. Выбор донорного штамма 54
1.5.3.8. Наличие филлосферы и ризосферы (листвы и корневой системы растений) 54
1.5.3.9. Присутствие почвенной биоты и перенос плазмид 55
1.6. Катаболические неплазмидные мобильные генетические элементы 56
1.6.1. Транспозоны 56
1.6.2. Геномные острова 59
1.6.3. Горизонтальный перенос катаболических неплазмидных МГЭ 61
1.7. Исследование биодеградации ПАУ 63
1.7.1. Биодеградация ПАУ в лабораторных условиях 68
1.7.2. Полевые и пилотные исследования биодеградации ПАУ 70
1.7.3. Увеличение скорости и степени деградации ПАУ 71
1.7.3.1. Способы повышения биодоступности ПАУ 71
1.7.3.2. Стимуляция метаболической активности микроорганизмов-деструкторов 73 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 75
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 75
2.2. Среды, источники углерода и антибиотики 77
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов 78
2.4. Трансформация клеток Е. соїі плазмидной ДНК 78
2.5. Коньюгационный перенос бактериальных плазмид 78
2.6. Выделение плазмидной ДНК 79
2.7. Визуализация плазмидной ДНК 79
2.8. Определение влагоемкости почвы 80
2.9. Приготовление модельных почвенных систем 80
2.10. Внесение инокулята в почву 80
2.11. Отбор проб 80
2.12. Экстракция нафталина из почвенных образцов 81
2.13. Определение концентрации нафталина в почвенных экстрактах 81 2Л4. Определение содержания салицилата в культуралыюй жидкости 81
2.15. Мониторинг маркированных плазмидосодержащих штаммов-деструкторов в процессе деградации нафталина в почве 82
2.16. Определение активностей ключевых ферментов биодеградации нафталина 82
2.17. Определение концентрации белка 83
2.18. Определение стабильности признаков утилизации нафталина и салицилата 83
2.19. Выделение тотальной ДНК бактериальных штаммов 84
2.20. Полимеразная цепная реакция 84
2.21. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 85
2.22. Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК 85
2.23. Устройство экспериментального открытого биореактора 85
2.24. Подготовка инокулята для биореактора 87
2.25. Мониторинг штаммов-деструкторов в культуралыюй среде 87
2.26. Определение остаточного содержания нефти и нефтепродуктов в культуральной среде
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 89
3.1. Конструирование маркированных штаммов-деструкторов P. putida KT2442(pNF142::TnMx/-OTc) и P. putida BS394(pNF142::TnMod-OTc) 89
3.2. Определение удельной скорости роста штаммов-деструкторов на нафталине 90
3.3. Стабильность признаков биодеградации и резистентности, контролируемых плазмидой pNF142::TnMod-OTc 90
3.4. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в лабораторных условиях 91
3.4.1. Характеристика аборигенных деструкторов нафталина 92
3.4.2. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерий-деструкторов нафталина в модельной почве 94
3.4.3. Динамика убыли нафталина в почве и горизонтальный перенос плазмид биодеградации в бактериальных популяциях 95
3.4.4. Оценка активности ключевых ферментов катаболизма нафталина бактерий-деструкторов 98
3.5. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации нафталина в почве в открытой окружающей среде 102
3.5.1. Мониторинг интродуцированных маркированных бесплазмидных и плазмидосодержащих штаммов, их выживаемости и конкурентоспособности в открытой окружающей среде 102
3.5.2. Горизонтальный перенос плазмид биодеградации в почвенных микробных популяциях 105
3.6. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в открытом биореакторе с протоком нефти и дизельного топлива 106
3.6.1 Характеристика аборигенных деструкторов нафталина 106
3.6.2. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерий-деструкторов в биореакторе 108
3.6.3. Деструкция дизельного топлива и нефти в биореакторе 109
3.6.4. Горизонтальный перенос катаболической плазмиды в проточном биореакторе
3.7. Разработка метода для оценки эффективности биодеградации нафталина 111
штаммами-деструкторами в модельных почвенных системах
4. ОБСУЖДЕНИЕ 121
ВЫВОДЫ 139
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 140
