СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................. 5
1. ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 6
1.1. Актуальность исследования и степень разработанности темы ............... 6
1.2. Научная новизна работы............................................................................ 7
1.3. Теоретическая и практическая значимость работы.................................. 8
1.4. Методология и методы диссертационного исследования........................ 9
1.5. Цель и задачи исследования ...................................................................... 9
1.6. Положения, выносимые на защиту ......................................................... 10
1.7. Личное участие автора в проведении исследований.............................. 11
1.8. Статьи ....................................................................................................... 11
1.9. Структура и объем диссертации.............................................................. 14
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................ 15
2.1. Этапы развития ЦНС млекопитающих................................................ 15
2.2. Этапы дифференцировки нейронов..................................................... 19
2.3. Регуляция экспрессии генов при дифференцировке ........................... 22
2.3.1. Специфические транскрипционные активаторы нейрональной
дифференцировки........................................................................................ 22
2.3.2. Активация пути CREB/c-FOS при стимуляции ДВП................... 25
2.3.3. Регуляция состояния хроматина и транскрипции ........................ 28
2.3.4. Ключевые события на хроматине, ведущие к изменениям
паттернов экспрессии нейрональных генов............................................... 30
2.3.5. Роль хроматин-ремоделирующих комплексов в регуляции
экспрессии генов ......................................................................................... 33
2.3.6. Роль хроматин-ремоделирующих комплексов в нейрогенезе ..... 41
2.3.7. Заболевания, вызванные мутациями в субъединицах хроматинремоделирующих комплексов .................................................................... 46
2.3.8. PHF10 - субъединица комплекса PBAF ........................................ 49
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ........................................................................ 54
3.1. Материалы............................................................................................. 54
3.1.1. Клеточные линии и среды, использованные в работе.................. 54
3.1.2. Реактивы ......................................................................................... 54
3.2. Методы .................................................................................................. 57
3.2.1. Содержание мышей........................................................................ 57
3.2.2. Препарирование мышей ................................................................ 57
3
3.2.3. Блот-гибридизация в варианте «нозерн» (Нозерн-блоттинг) ...... 58
3.2.4. Блот-гибридизация в варианте «вестерн» (Вестерн-блоттинг) ... 59
3.2.5. Электрофорез в ПААГ ................................................................... 60
3.2.6. Иммунопреципитация.................................................................... 61
3.2.7. Очистка комплексов PBAF, содержащих PHF10 ......................... 61
3.2.8. Иммунопреципитация хроматина и приготовление библиотеки 63
3.2.9. Получение ядерной и цитоплазматической фракций из
экстрактов головного мозга мыши ............................................................. 66
3.2.10. Приготовление замороженных срезов .......................................... 68
3.2.11. Иммуногистохимическое выявление белка на срезах ................. 68
3.2.12. Получение первичной диссоциированной культуры нейронов .. 69
3.2.13. Дифференцировка клеток линии Neuro 2A .................................. 70
3.2.14. Дифференцировка клеток линии SH-SY5Y.................................. 71
3.2.15. Культивирование клеток линии HEK 293Т .................................. 72
3.2.16. Стимуляция ДВП ........................................................................... 72
3.2.17. Иммуногистохимическое окрашивание культуры нейронов ...... 73
3.2.18. Флуоресцентная микроскопия....................................................... 74
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................................... 75
4.1. Экспрессия изоформ PHF10 во взрослом мозге мыши и человека
является специфичной для нейронов............................................................. 75
4.2. Изучение экспрессии изоформ PHF10 в процессе развития головного
мозга мыши ..................................................................................................... 79
4. 2.1. В процессе развития головного мозга мыши транскрипты
изоформ PHF10-Pl и -Ps замещаются транскриптами PHF10-Ss и Sl....... 79
4. 2.2. При переходе нейрональных предшественников в постнатальные
нейроны изоформа PHF10-Pl замещается на изоформу PHF10-Ss........... 81
4. 2.3. Нейрональная дифференцировка клеток нейробластомы мыши и
человека сопровождается сменой изоформ PHF10 ................................... 84
4.3. Изоформы PHF10 в составе комплекса PBAF сильно
фосфорилированы........................................................................................... 87
4.4. Изоформы PHF10-Pl и PHF10-Ss входят в состав комплексов PBAF,
отличающихся биохимическими свойствами................................................ 89
4.5. Комплексы PBAF, включающие PHF10-Pl и PHF10-Ss изоформы,
отличаются субъединичным составом........................................................... 92
4.6. Комплексы PBAF, содержащие PHF10-Ss изоформы, локализуются на
промоторах специфических нейрональных генах и генах «домашнего
хозяйства»........................................................................................................ 95
4.7. PHF10 локализуется в цитоплазме и ядрах нейронов мозжечка
головного мозга мыши.................................................................................. 100
4.8. В цитоплазме нейронов мозжечка взрослой мыши преимущественно
экспрессируется изоформа PHF10-Ss .......................................................... 102
4
4.9. При инициации ДВП PHF10 меняет свою локализацию аналогично
транскрипционному активатору c-FOS........................................................ 104
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..........................................................................................111
6. ВЫВОДЫ................................................................................................... 116
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................... 117
ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................ 132
