ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ..............................................................................................................................................5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................................11
1.1. Вирус энцефаломиокардита 1 серотипа (EMCV-1). Штамм Менго .........................................11
1.1.1. Общая характеристика семейства Picornaviridae ....................................................................11
1.1.2. Особенности строения ................................................................................................................15
1.1.3. Род Cardiovirus ............................................................................................................................16
1.1.4. Вирус энцефаломиокардита 1 серотипа, штамм Менго ..........................................................17
1.2. Характеристика белков L и 2А EMCV-1 .....................................................................................20
1.2.1. Секьюрити-белки пикорнавирусов ............................................................................................20
1.2.2. Характеристика лидерного белка вируса энцефаломиокардита ............................................22
1.2.3. Характеристика белка 2А EMCV-1 ...........................................................................................24
1.3. Изменение клеточной трансляции при пикорнавирусной инфекции .......................................27
1.3.1. Кэп-зависимый механизм инициации трансляции и его регуляция ......................................27
1.3.2. Изменение клеточной трансляции при пикорнавирусной инфекции ....................................30
1.4. Модификация клеточной гибели при пикорнавирусной инфекции ..........................................32
1.4.1. Апоптотическая гибель ...............................................................................................................33
1.4.2. Некротическая гибель .................................................................................................................35
1.4.3. Модификация клеточной гибели при пикорнавирусной инфекции .......................................38
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..............................................................................................41
2.1. Методы работы с культурами эукариотических клеток .............................................................41
2.1.1. Клеточные линии.........................................................................................................................41
2.1.2. Культивирование клеток ............................................................................................................41
2.2. Методы работы с нуклеиновыми кислотами ...............................................................................41
2.2.1. Плазмидные ДНК ........................................................................................................................41
2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) .......................................................................................42
2.2.3. Рестрикция ДНК ..........................................................................................................................43
2.2.4. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле ..................................43
3
2.2.5. Препаративный электрофорез, выделение и очистка фрагментов ДНК................................43
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК ..................................................................................................44
2.2.7. Наработка плазмидных ДНК в культуре клеток бактерий .....................................................44
2.2.8. Выделение плазмидной ДНК в аналитических целях .............................................................44
2.2.9. Выделение плазмидной ДНК для препаративных целей ........................................................45
2.2.10. Транскрипция in vitro ................................................................................................................46
2.2.11. Выделение вирусной РНК ........................................................................................................46
2.2.12. Обратная транскрипция ............................................................................................................46
2.2.13. Секвенирование .........................................................................................................................47
2.2.14. Количественный ПЦР в режиме реального времени .............................................................47
2.2.15. Получение плазмидных ДНК pM16.2_Δ2A и pM16.1_C19A/С22А_Δ2A, содержащих
полногеномные копии мутантов Δ2A и Zfmut&Δ2A штамма Менго EMCV-1 ..............................48
2.2.16. Получение плазмидной ДНК pM16.2_VP2mut ......................................................................51
2.3. Методы работы с вирусами ...........................................................................................................52
2.3.1. Используемые вирусы ................................................................................................................52
2.3.2. Трансфекция культуры клеток BHK-21 вирусной РНК ..........................................................53
2.3.3. Титрование вирусов методом негативных колоний ................................................................53
2.3.4. Клонирование методом негативных колоний ..........................................................................54
2.3.5. Получение рабочего пула вирусов ............................................................................................54
2.3.6. Заражение монослоя клеток вирусами ......................................................................................55
2.4. Экспериментальные методы изучения трансляционных процессов и клеточной гибели при
вирусной инфекции ...............................................................................................................................55
2.4.1. Флуоресцентный анализ деградации клеточной ДНК.............................................................55
2.4.2. Детекция проницаемости цитоплазматической мембраны .....................................................56
2.4.3. Оценка жизнеспособности клеток .............................................................................................57
2.4.4. Вестерн-блот гибридизация .......................................................................................................57
2.4.5. Изучение уровня синтеза белков с помощью пульс-метода включения радиоактивно
меченых аминокислот ...........................................................................................................................58
2.5. Статистическая обработка .............................................................................................................60
4
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ .....................................................................................................................61
3.1. Получение и характеристика лабораторных штаммов EMCV-1, мутантных по белкам L и 2А
.................................................................................................................................................................61
3.1.1. Получение мутантных EMCV-1 и характеристика фенотипа негативных колоний ............61
3.1.2. Генетическая характеристика полученных мутантных EMCV-1 ...........................................63
3.1.3. Характеристика эффективности репродукции полученных мутантных штаммов EMCV-1 в
различных культурах клеток ................................................................................................................65
3.2. Изучение роли белков L и 2А в модификации процесса синтеза белков в зараженных клетках
.................................................................................................................................................................68
3.2.1. Ингибирование синтеза белков в клетках HeLa .......................................................................68
3.2.2. Накопление вирусных белков и их процессинг при инфекции клеток HeLa ........................72
3.2.3. Синтез белков при инфекции клеток BHK-21 ..........................................................................75
3.3. Изучение механизмов клеточной гибели при кардиовирусной инфекции и роли белков 2А и
L в этом процессе ..................................................................................................................................77
3.3.1. Культура клеток HeLa .................................................................................................................77
3.3.2. Культура клеток BHK-21 ............................................................................................................83
3.3.3. Культура клеток RD ....................................................................................................................85
3.4. Изучение возможности ингибирования развития клеточной патологии при инфекции EMCV
1 ...............................................................................................................................................................87
3.4.1. Изучение кинетики гибели клеток HeLa при инфекции мутантными EMCV-1 в присутствии
ингибитора каспаз QVD-OPH ..............................................................................................................88
3.4.2. Изучение жизнеспособности клеток при инфекции мутантными EMCV-1 в присутствии
ингибитора каспаз QVD-OPH ..............................................................................................................94
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................................................97
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................................110
ВЫВОДЫ .............................................................................................................................................112
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ .............................................................................................113
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ .............................................................113
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ......................................................114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................................117
