Введение
1. Обзор литературы (Внеклеточная ДНК – биологически активная молекула) 16
1.1. Свойства внеклеточной ДНК 17
1.1.1. Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК 17
1.1.2. Концентрация вкДНК 21
1.1.3. Фрагментация вкДНК 23
1.1.4. Содержание различных последовательностей в составе вкДНК 26
1.1.5. Эпигенетические модификаци вкДНК: метилирование фрагментов вкДНК 30
1.1.6. Окислительная модификация оснований вкДНК 31
1.1.7. Свойства вкДНК определяют ее характеристики как маркера при
патологии и при опасных для генома воздействиях 1.1.7.1. Применение вкДНК в качесве маркера ранней диагностики в
онкологии 1.1.7.2. Применение вкДНК в качесве маркера в пренатальной диагностике,
транспланталогии и других областях диагностики 1.2. Происхождение вкДНК. Механизм появления вкДНК в циркуляции 42
1.3. Формы существования вкДНК 48
1.4. Биологическая активость вкДНК 53
1.4.1. ВкДНК как активатор иммунных реакций 53
1.4.2. ВкДНК как фактор стресс-сигнализации в индуцированном
ионизирующей радиацией эффекте свидетеля 1.5. Способы проникновения вкДНК внутрь клетки 58
1.6. Внутриклеточные рецепторы, опознающие фрагменты вкДНК 60
1.6.1. Белки семейства TLR – сенсоры фрагментов вкДНК 61
1.6.1.1. Общая характеристика белков TLR 61
1.6.1.2. Природные и синтетические лиганды TLR9 64
1.6.1.3. Ингибиторы взаимодействия CрG -ДНК с TLR9 67
1.6.1.4. Механизм доставки лигандов к TLR, расположенным на эндосомах 70
1.6.1.5. Шапероны – роль в подготовке и перемещении TLR в эндосомы 75
1.6.1.6. Как иммунная система отличает нуклеиновые кислоты
болезнетворных микроорганизмов и собственные нуклеиновые кислоты 1.6.2. Другие рецепторы - кандидаты на роль связывания вкДНК 82
1.6.2.1. ZBP1 или DAI – сенсор цитозольной ДНК 84
1.6.2.2. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 85
1.6.2.3. AIM2 и инфламмасома 1.7. Внеклеточная ДНК – индуктор окислительного стресса в клетках 88
1.7.1. Роль фермента NOX4 в синтезе активных форм кислорода,
индуцированном вкДНК 1.8. Внеклеточная ДНК принимает участие в регуляции клеточного цикла 92 1.9. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, активирующиеся в клетках 96
при действии внеклеточной ДНК
1.9.1. Внеклеточная ДНК вызывает активацию транскрипционного фактора
NF-kB 1.9.2. Внеклеточная ДНК вызывает активацию ядерного фактора NRF2 100
1.9.3. Взаимодействие между NRF2 - и NF-kB - сигнальными путями 102
1.10. Заключение по данным литературы 104
2. Материалы и методы. 106
2.1. Анализируемая выборка 106
2.2. Выделение внеклеточной ДНК 106
2.3. Определение концентрации и размеров фрагментов ДНК вкДНК 107
2.4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК
107
2.5. Определение нуклеазной активности 108
2.6. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах 108
2.7. Культивирование мезенхимных стволовых клеток (МСК) 109
2.8. Культивирование HUVEC (клеток эндотелия из вены пуповины) 109 2.9 Культивирование фибробластов 109
2.10. Выделение лимфоцитов 109
2.11. Приготовление образцов ДНК 110
2.12. Определение количества активных форм кислорода 111
2.13. Определение уровня окиси азота в клетках 111
2.14. Определение количества нитритов и нитратов (метаболитов окиси азота)
в среде культивирования
111
2.15 Определение f-актина 111
2.16. Определение содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) в 112
составе вкДНК
2.17. Определение одно- и двуцепочечных разрывов ДНК в клетках. Метод 112 ДНК-комет (single cell gel electrophoresis)
2.18. Определение двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток методом 112 иммунофлуоресценции
2.19. Анализ разрывов ДНК в клетках методом TUNEL 113
2.20. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 113
2.21. Определение ферментативной активности каспазы 3 113
2.22. Определение уровня экспрессии белков 114
2.23. Ингибирование TLR9 клеточного пути 114
2.24. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 114
2.25. Статистическая обработка результатов 118
3. Результаты и обсуждение 119
3.1. свойства внеклеточной ДНК. Поиск свойств, определяющих 1 1 9
биологическую активность вкДНК
3.1.1. Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса
3.1.1.2. Концентрация вкДНК зависит от нуклеазной активности плазмы крови 124
3.1.2. Длины фрагментов внДНК 126
3.1.3. Концентрация повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови
127
3.1.3.1. ГЦ-богатая последовательность рибосомного повтора накапливается в составе вкДНК
130
3.1.3.2. Содержание АТ-богатой последовательности генома в циркулирующей вкДНК плазмы крови лиц, подвергавшихся 133
профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения снижено по сравнению с контрольной группой
3.1.4. Окислительная модификация вкДНК 135
3.1.5. Фрагменты рДНК, накапливающейся в составе вкДНК, образует в крови комплексы с антителами
3.1.5.1 Титры антител к рДНК в выборке облученных лиц выше, чем в контрольной 141
3.2. Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность генома гистологически различных культивируемых клеток человека с разным 143
пролиферативным потенциалом
3.2.1. Общая схема эксперимента 143
3.2.2. Характеристика культивируемых клеток 144
3.2.3. Характеристика образцов вкДНК и модельных фрагментов 146
3.2.4. Локализация окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК в клетках разных типов 152
3.2.5. Изменение уровня активных форм кислорода в разных типах клеток при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 156
3.2.5.1. Количество АФК в HUVEC определяется свойствами вкДНК 157
3.2.5.2. Синтез АФК в МСК при воздействии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК 165
3.2.5.3. Окисленные вкДНК индуцируют в раковых клетках MCF-7 кратковременный окислительный стресс 171
3.2.5.4. Изменение уровня активных форм кислорода в фибробластах при действии гДНК и гДНКокси 175
3.2.6. Окислительные модификации вкДНК индуцируют повышение уровня окислительных модификаций собственной ДНК в ядрах клеток 178
3.2.7. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют кратковременную экспрессию NOX4 в разных типах клеток
181
3.2.8. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают быстро репарируемые разрывы ДНК ядер клеток
187
3.2.8.1. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают в ядрах HUVEC быстро репарируемые разрывы ДНК 188
3.2.8.2. Внеклеточная ДНК с измененными свойствами стимулирует образование и репарацию разрывов хроматина культивируемых мезенхимных стволовых клеток человека
3.2.8.3. Окисленные вкДНК стимулируют увеличение количества разрывов ДНК в ядрах клеток MCF-7 199
3.2.8.4. Окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень двунитевых разрывов в HEF и HDF , культивируемых в условиях окислительного стресса 203
3.2.9. Окисленные вкДНК повышают уровень нестабильности генома 206
3.2.9.1. Окисленные фрагменты вкДНК транзиторно увеличивают содержание фракции subG1 в разных типах клеток 210
3.2.10. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов клеток 212
3.2.10.1. Снижение содержания Ki-67 в клетках в ответ на присутствие вкДНК 212
3.2.10.2. Изменение экспрессии маркера пролиферации и репарации PCNA в клетках в ответ на присутствие фрагментов вкДНК 216
3.2.11. ВкДНК вызывает остановку клеточного цикла 220
3.2.11.1. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК
223
3.2.12. Активация процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК
227
3.2.12.1. Изменение пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района 1q12 при действии фрагментов 229
вкДНК
3.2.13. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень гибели клеток разных типов 232
3.2.14. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают количество клеток с признаками апоптоза в разных клеточных популяциях
237
3.2.14.1. ВкДНК снижает активность каспазы 3 в клетках разных типов 240
3.2.14.2. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции апоптоза при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 241
3.2.15. ВкДНК повышает транскрипционную активность клеток 247
3.2.16. TLR9 – рецептор, через который фрагменты вкДНК реализуют стимулирующее действие
249
3.2.16.1. ВкДНК больных ревматоидным артритом, модельные ГЦ- богатые фрагменты увеличивают экспрессию гена TLR9 в лимфоцитах человека 250
3.2.16.2. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в эмбриональных фибробластах легкого человека
252
3.2.16.3. ГЦ-ДНК снижает экспрессию TLR9 в лимфоцитах больного СКВ 252
3.2.16.4. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию TLR9 в СD34+ клетках и мононуклеарах костного мозга
254
3.2.16.5. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК активируются рецепторы TLR9 в МСК
255
3.2.16.6. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК реализуют свое активирующее действие на HUVEC с участием TLR9
264
Изменение уровня экспрессии белка TLR9 при действии на HUVEC вкДНК с измененными свойствам
Изменение уровня экспрессии TLR9 в MCF7 при действии вкДНК с измененными свойствами 268
3.2.16.8. ГДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК TLR9 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 271
3.2.17. Участие рецепторов АIМ2 в проведении сигнала от вкДНК в клетках
3.2.17.1. Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в МСК
3.2.17.2. ВкДНК повышает уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в HUVEC
человека
3.2.17.3. Изменение экспрессии рецептора AIM2 на уровне гена и на уровне
белка при действии фрагментов вкДНК на культуру раковых клеток MCF-7
280
3.2.17.4. Геномая ДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК AIM2 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 283
3.2.18. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 284
3.2.18.1. Влияние вкДНК на уровень экспрессии гена RIG1 в МСК 285
3.2.18.2. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в HUVEC 287
3.2.18.3. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в MCF7 и HDF 288
3.2.19. Роль STING в проведении сигнала от вкДНК 289
3.2.20. Влияние вкДНК на экспрессию белков семейства TLR 291
3.2.21. ВкДНК активирует TLR-сигнальный путь 296
3.2.21.1. Изменение уровня экспрессии гена MyD88 –адаптера TLR сигнального пути в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК)
296
3.2.21.2. Динамика изменения количества мРНК гена MyD88 – адаптера TLR-сигнального пути в ответ на стимуляцию HUVEC и MCF7 фрагментами 301
вкДНК
3.2.21.3. Влияние фрагментов вкДНК на активацию адаптера TLR9 сигнального пути – MyD88 на уровне транскрипции в лимфоцитах, CD34+ клетках костного мозга и фибробластах
3.2.22. ВкДНК активирует NF-kB- сигнальный путь в разных типах клеток 303
3.2.22.1. ВкДНК активирует экспрессию генов NF-kB - сигнального пути в МСК 304
3.2.22.2. Фрагменты вкДНК активируют экспрессию транскрипционного фактора NF-kB (RelА или p65) и его перемещение в ядро в МСК
307
3.2.22.3. Активация процессов транскрипции генов цитокинов при действии фрагментов п(рДНК) на МСК. Активация синтеза цитокинов - IL10 и TNF 312
фрагментами ГЦ-обогащенной вкДНК
3.2.22.4. Изменение экспрессии генов молекул сигнального каскада, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, в HUVEC при действии
3.2.22.5. Влияние фрагментов вкДНК на количества белка р65 и его локализацию в HUVEC
3.2.22.7. Изменение уровня экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1, контролируемых фактором NF-kB, при действии окисленных и ГЦ 3.2.22.6. ВкДНК повышает экспрессию генов цитокинов IL8, IL6, IL10 и
TNFа в HUVEC богатых фрагментов вкДНК в HUVEC 321
3.2.22.8. ГЦ-обогащенная п(рДНК) активирует NF-kB - сигнальный путь в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров 322
3.2.22.9. Активация экспрессии генов NF-kB – сигнального пути образцами окисленной и неокисленной вкДНК в MCF7 324
3.2.22.10. Влияние окисленных фрагментов вкДНК на активность NF-kB – сигнального пути в фибробластах в условиях окислительного стресса 238
3.2.23. Активация фрагментами вкДНК NRF2 – сигнального пути 331
3.2.23.1. вкДНК активирует NRF2 – сигнальный путь в МСК 332
3.2.23.2. Активация NRF2- сигнального пути фрагментами вкДНК в HUVEC 336
3.2.23.3. Окисленные и неокисленные образцы вкДНК снижают активность транскрипционного фактора NRF2 и активируют транскрипционный фактор STAT3 в клетках MCF7
3.2.23.4. Окисленные вкДНК активируют NRF2 – сигнальный путь в фибробластах
341
3.2.23.5 Изменение уровня экспрессии гена SOD1 при действии ГЦ-богатых и окисленных ДНК в разных типах клеток 342
3.2.24. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в разных типах клеток 346
3.2.24.1. Активация экспрессии STAT3 фрагментами вкДНК в МСК 347
3.2.24.2. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в
3.2.24.3. Активация STAT3 - сигнального пути фрагментами вкДНК в MCF-7 350
3.2.25. Активация транскрипционного фактора PPARG2 фрагментами вкДНК в клетках разных типов 353
3.2.26. Окисленная вкДНК – фактор стресс-сигнализации в передаче сигнала при радиационно-индуцируемом эффекте свидетеля 357
3.2.27. Окисленная вкДНК повышает устойчивость HDF к ионизирующей радиации
3.2.28. Воздействие ГЦ- ДНК улучшает выживаемость МСК после облучения 359
3.2.29. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют в МСК устойчивость к
повреждающему действию этанола 361
3.2.30. Влияние изменения свойств вкДНК на специфическую функциональную активность клеток
3.2.30.1. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в HUVEC
3.2.30.2. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина 368
3.2.30.3. Повышение экспрессии генов миогенной дифференцировки при
действии вкДНКокси на МСК
374
Выводы 389
Применение результатов научных выводов 389
Список литературы
