Введение
Глава 1. Вечная мерзлота как экстремальное место обитания для микроорганизмов 10
1.1 Характеристика и структура 10
1.2 Микробное разнообразие в экосистемах многолетнемерзлых отложений 14
1.3 Метаболическая активность in situ 19
Глава 2. Домен Archaea: разнообразие и распространение 23
2.1 Происхождение и эволюция 23
2.3 Методы изучения архейного разнообразия 34
2.4 Некультивируемое разнообразие архей в вечной мерзлоте 36
Глава 3. Метанобразующие археи 38
3.1 Общая характеристика и распространение 38
3.2 Современные представления о филогении метаногенов 43
3.3 Метаболическая кооперация метаногенов с другими микроорганизмами.. 46
3.4 Метаногенные археи из постоянно холодных экосистем 48
3.5 Метаногенные археи - модельные объекты для астробиологических исследований 51
Заключение по обзору литературы 53
Экспериментальная часть 55
Глава 4. Материалы и методы исследования 55
4.1 Район исследования и отбор проб 55
4.2 Объекты исследования 56
4.3 Среды и условия культивирования 57
4.4 Микроскопические методы 58
4.5 Изучение физиолого-биохимических свойств микроорганизмов 59
4.6 Аналитические методы 60
4.6.1 Определение уксусной кислоты 60
4.6.2 Определение водорода . 60
4.6.3 Определение белка биомассы 60
4.6.4 Определение каталазы и оксидазы 60
4.6.5 Определение липидного состава клеток 61
4.6.6 Анализ жирнокислотного состава клеток . 61
4.7 Эксперименты по влиянию перхлоратов на рост метаногенов . 61
4.8 Молекулярно-генетические методы . 63
4.8.1 Выделение и очистка ДНК . 63
4.8.2 Амплификация генов 16S рРНК и mcrA 64
4.8.3 Создание клоновых библиотек генов 16S рРНК и mcrA 65
4.8.4 Секвенирование 65
4.8.5 Статистический анализ последовательностей . 65
4.8.6 Филогенетический анализ . 65
4.8.7 Определение и расчет содержания Г+Ц пар в ДНК 66
4.8.8 ДНК-ДНК гибридизация 66
4.9 Времяпролетная МАЛДИ-масс спектрометрия 66
Глава 5. Результаты и обсуждение . 68
5.1 Исследование разнообразия архей в многолетнемерзлых образцах различного возраста 68
5.1.1 Создание клоновой библиотеки гена 16S рРНК . 69
5.1.2 Создание клоновой библиотеки гена mcrA 73
5.2 Описание нового вида метаносарцины 77
5.3 Бактериальный спутник ‘Methanosarcina gilichinskiia’ JL01T 83
5.3.1 Описание Sphaerochaeta associata GLS2T sp.nov . 84
5.3.2 Влияние S. associata GLS2T на рост и метаногенез ‘M. gilichinskiia’ T 93
JL01
5.4 Метанобразующие археи мерзлоты – модельные организмы для астробиологии 94
5.4.1 Определение ингибирующих концентраций перхлоратов на рост метаногенных архей 95
5.4.2 Образование метана в культуральной среде, содержащей перхлораты 96
5.4.3 Влияние перхлоратов на морфологию клеток М. arcticum М2Т . 101
5.5 Идентификация метаногенных архей с помощью МАЛДИ масс-спектрометрии 102
Заключение 110
Выводы 112
Список сокращений 113
Список литературы 114
Приложение 1 151
Приложение 2 156
