ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 6
Актуальность темы исследования ............................................................................. 6
Степень разработанности темы исследования ......................................................... 8 Цель исследования .................................................................................................... 11
Задачи исследования ................................................................................................. 11
Научная новизна исследования ............................................................................... 12
Теоретическая и практическая значимость работы ............................................... 13
Методология и методы исследования .................................................................. 14
Материалы исследования ....................................................................................... 15
Объект исследования, материал, пробоподготовка образцов .......................... 15
Штаммы микроорганизмов, использованные для разработки тест-системы для выявления и дифференциации МБТ и НТМБ ..................................................... 15
Штаммы микроорганизмов, использованные для разработки тест-системы для видовой идентификации НТМБ............................................................................... 17
Образцы клинического материала от больных, использованные в исследовании, и их предобработка....................................................................................................... 17
Методы исследования ............................................................................................... 18
Микробиологические методы исследования.......................................................... 18
Молекулярно-генетические методы исследования ............................................... 19
Отбор культур и клинического материала от больных ......................................... 21
Программное обеспечение и базы данных ............................................................. 23 Расчет содержания геном-эквивалентов в образцах ДНК .................................... 24
Методы статистической обработки результатов ................................................... 24
Личное участие автора в получении результатов .................................................. 25
Основные положения диссертации, выносимые на защиту ................................. 26
Степень достоверности и апробация результатов ................................................. 26
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 28
1.1 Микобактерии...................................................................................................... 28
4
1.2 Возбудитель туберкулёза ................................................................................... 29
1.3 Возбудители микобактериоза ............................................................................ 33
1.4 Лабораторная диагностика туберкулёза и микобактериоза ........................ 41
1.4.1 Микробиологические методы выявления и идентификации микобактерий и определения их лекарственной чувствительности ................................................ 42
1.4.2 Ускоренные методы выявления и идентификации микобактерий ............. 51
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .. 74
ГЛАВА 2. Разработка тест-системы ПЦР-РВ(д) на основе ПЦР-РВ для одновременного выявления ДНК МБТК и НТМБ в одном образце диагностического материала/культуры .................................................................. 74
2.1 Разработка праймеров и Taq-Man зондов для выявления НТМБ и их дифференциации от МБТК....................................................................................... 74
2.2 Оценка чувствительности и специфичности тест-системы ПЦР-РВ(д) для одновременного выявления ДНК МБТК и НТМБ на ДНК, выделенной из культур микроорганизмов....................................................................................................... 82
2.3 Оценка чувствительности и специфичности тест-системы ПЦР-РВ(д) для одновременного выявления ДНК МБТК и НТМБ на ДНК, выделенной из образцов клинического материала .......................................................................... 84
2.4 Оценка 95% предела обнаружения (LoD95%) ДНК микобактерий в пробе клинического материала ........................................................................................... 90
2.6 Оценка внутрипостановочной сходимости и межпостановочной воспроизводимости результатов выявления микобактерий для тест-системы ПЦР-РВ(д) ........................................................................................................................... 91
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ПЦР-РВ(И) НА ОСНОВЕ ПЦР-РВ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ НТМБ В ОБРАЗЦАХ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА/КУЛЬТУР ОТ БОЛЬНЫХ ............... 93
3.1 Отбор видов НТМБ для разработки тест-системы ПЦР-РВ(и) для видовой идентификации НТМБ в образцах диагностического материала/культур от больных ...................................................................................................................... 93
5
3.2 Разработка праймеров и Taq-Man зондов и дизайна тест-системы ПЦР-РВ(и) для видовой идентификации НТМБ........................................................................ 95
3.3 Оценка аналитической чувствительности и специфичности тест-системы ПЦР-РВ(и) для видовой идентификации НТМБ в образцах культур ......................... 105
3.4 Оценка эффективности ПЦР для видов НТМБ, идентифицируемых разработанной тест-системой ПЦР-РВ(и) ............................................................ 108
3.5 Оценка чувствительности и специфичности тест-системы ПЦР-РВ(и) для видовой идентификации НТМБ в образцах клинического материала и образцах культур, полученных из этого клинического материала .................................... 109
3.6 Оценка внутрипостановочной сходимости и межпостановочной воспроизводимости результатов идентификации НТМБ для тест-системы ПЦР-РВ(и) ......................................................................................................................... 112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................... 114
ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 124
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ................................................................. 126
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ ................................ 127
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................... 128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................... 130
ПРИЛОЖЕНИЯ ....................................................................................................... 173
Приложение №1....................................................................................................... 173
Приложение №2....................................................................................................... 175
Приложение №3....................................................................................................... 177
Приложение №4....................................................................................................... 181
Приложение №5....................................................................................................... 185
Приложение №6....................................................................................................... 197
Приложение №7....................................................................................................... 198
