Введение
Глава I. Обзор литературы 14
1.1. Таргетная терапия ERBB2-положительных опухолей 14
1.1.1. Моноклональные ERBB2-специфичные антитела и низкомолекулярные ингибиторы, используемые для таргетной терапии 17
1.1.2. Разработка таргетных препаратов на основе альтернативных скаффолдов 21
1.2. Использование особенностей строения дарпинов в исследованиях и биотехнологии 23
1.3. Применение дарпинов в качестве связывающих модулей 27
1.4. Опухолеспецифические токсины на основе дарпинов 29
1.5. Применение дарпинов в адресной фотодинамической терапии 31
1.6. Применение дарпинов для доставки наночастиц 34
1.7. Применение дарпинов для создания онколитических вирусов 36
1.8. Применение дарпинов для создания химерных антигенных рецепторов 37
1.9. Заключение 39
Глава II. Материалы и методы 40
2.1. Наработка и выделение рекомбинантных белков 40
2.1.1. Получение бактериальных компетентных клеток 40
2.1.2. Трансформация компетентных клеток 41
2.1.3. Экспрессия целевых белков в бактериальной системе 41
2.1.4. Хроматографическая очистка белков 42
2.1.5. Электрофорез полученных фракций белка в денатурирующем ПААГ и визуализация 42
2.2. Определение специфичности связывания рекомбинантных белков на основе DARPin 9 29 с ERBB2-положительными опухолевыми клетками методом проточной цитофлуориметрии 43
2.2.1. Конъюгация белка DARPin 9-29 с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) 44
2.2.2. Взаимодействие белков c поверхностью клеток 44
2.2.3. Взаимодействие белка DARP-miniSOG с клетками SK-BR-3 в присутствии конкурирующего полипептида DARPin 9-29 45
2.3. Определение специфической цитотоксичности адресных токсинов на основе DARPin 9 29 45
2.3.1. Определение специфической цитотоксичности белка DARPin-miniSOG 46
2.4. Оценка скорости интернализации комплекса ERBB2 c DARPin-miniSOG методом проточной цитофлуориметрии 47
2.5.Изучение рециклизации рецептора после интернализации комплекса ERBB2/DARPin miniSOG методом проточной цитофлуориметрии 48
2.6. Изучение интернализации белка DARPin-miniSOG в составе комплекса с рецептором ERBB2 и его внутриклеточной локализации методом конфокальной микроскопии 49
2.7. Установление причин снижения интенсивности флуоресценции белка DARPin-miniSOG в эндосоме 49
2.8. Установление механизма клеточной гибели клеток, подвергнутых воздействию адресных токсинов на основе DARPin 50
2.9. Оценка противораковой эффективности, общей токсичности и иммуногенности белков на основе DARPin 9-29 in vivo 51
2.9.1. Животные 51
2.9.2. Схемы введения адресных токсинов DARPin-PE40 и DARPin-LoPE 52
2.9.3. Оценка неспецифической токсичности адресных токсинов 53
2.9.4. Оценка иммуногенности адресных токсинов 54
Глава III. Результаты и обсуждение 56
3.1. Выделение и характеристика белка DARPin 56
3.2. Выделение и характеристика рекомбинантного белка DARPin–mCherry 57
3.3. Выделение и характеристика рекомбинантного белка DARPin–miniSOG 59
3.3.1.Наработка и выделение белка DARPin-miniSOG 59
3.3.2. Подтверждение способности рекомбинантного белка DARPin-miniSOG специфично связываться с клетками методом проточной цитофлуориметрии 60
3.3.3. Определение токсичности DARPin-miniSOG в отношении ERBB2-положительных клеток 62
3.3.4. Установление механизма гибели клеток, подвергнутых воздействию адресного фототоксина DARPin-miniSOG 64
3.3.5. Подтверждение интернализации комплекса DARPin-miniSOG с рецептором ERBB2 методом проточной цитофлуориметрии 66
3.3.6.Оценка вклада рециклизации в восстановление исходного количества рецептора на мембране после интернализации комплекса ERBB2/DARPin-miniSOG 69
3.3.7. Изучение интернализации белка DARPin-miniSOG в составе комплекса с рецептором ERBB2 и его колокализации с лизосомами с помощью конфокальной микроскопии 71
3.3.8. Сравнение скорости интернализации DARPin-miniSOG и 4D5scFv-miniSOG 72
3.3.9. Установление механизма гашения miniSOG в эндосомах 74
3.4. Противораковая активность белков DARPin-PE40 и DARPin-LoPE in vitro 77
3.4.1. Токсичность белков DARPin-PE40 и DARPin-LoPE in vitro 78
3.4.2. Механизм клеточной гибели 3.5. Оценка эффективности DARPin-PE40 и DARPin-LoPE на ксенографтных моделях рака 80
3.6. Токсичность и иммуногенность адресных токсинов DARPin-LoPE и DARPin-PE40 83
3.6.1. Исследование общей токсичности DARPin-PE40 и DARPin-LoPE 83
3.6.2. Исследование иммуногенности DARPin-PE40 и DARPin-LoPE40 87
Заключение 90
Выводы: 92
Список литературы 94
Благодарности 109
