Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 Разработка плазмидных векторов 13
1.1.1 Плазмидные векторы in vitro 13
1.1.2 Плазмидные векторы in vivo 16
1.2. Элементы, влияющие на эффективность плазмидных векторов 20
1.2.1 CG-островки и CpG-динуклеотиды 20
1.2.1.1 Основные механизмы метилирования CpG 20
1.2.1.2 Основные механизмы деметилирования CpG 22
1.2.1.3 Общие сведения о CG-островках 23
1.2.1.4 Механизмы гипометилирования CG-островков 25
1.2.1.5 Дифференциальное метилирование CG островков 26
1.2.1.6 Метилирование CG-островков и транскрипция 30
1.2.2 S/MAR элементы 33
1.3. Заключение 36
2. Материалы и методы 37
2.1. Получение, наработка и выделение плазмид 37
2.2. Культивирование клеток 37
2.3. Электропорация мезенхимальных стволовых клеток 38
2.4. Определение концентрации плазмиды в клетках после электропорации с помощью ПЦР в реальном времени 39
2.5. Измерение люциферазной активности светлячковой (Firefly) люциферазы и секретируемой (Lucia) люциферазы 40
2.6. Анализ экспрессии -галактозидазы и eGFP 41
2.7. Лабораторные животные 41
2.8. Введение плазмид в задние конечности и в печень мышей 42
2.9. Забор крови и измерение mSEAP 42
2.10. Статистический анализ 42
3. Результаты 43
3.1. Создание генетических конструкций 43
3.2 Тестирование конструкций in vitro 50
3.2.1 Выбор между вектором pMBR1 и pMBR2 50
3.2.2 Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе и трансгене на начальный уровень экспрессии трансгена 51
3.2.3 Измерение количества плазмиды в клетках после электропорации 52
3.2.4 Кинетика экспресии конструкций, кодирующих люциферазу, в МСК 54
3.2.5 Влияние единичных CpG-динуклеотидов на кинетику экспрессии 59
3.2.6 Влияние RG108 на кинетику экспрессии трансгенов 60
3.2.7 Влияние ДМСО на кинетику экспрессии трансгенов 62
3.2.8 Влияние содержания CpG-динуклеотидов в векторе на экспрессию -галактозидазы и EGFP 63
3.3. Тестирование конструкций in vivo 72
3.3.1 Введение конструкций в скелетные мышцы 72
3.3.2 Введение конструкций в печень 75
4. Обсуждение результатов 77
4.1 Обсуждение результатов, полученных в системе in vitro 77
4.2 Обсуждение результатов, полученных в системе in vivo 82
5. Заключение 86
6. Выводы 90
Библиография 92
