Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Микроорганизмы в многолетнемерзлых отложениях 8
1.2. Устойчивость микроорганизмов к ртути 11
1.2.1. Содержание устойчивых к ртути бактерий в природных популяциях 11
1.2.2. Механизмы устойчивости к ртути 13
1.2.3. Строение тег-оперонов и их распространение в природных популяциях бактерий ... 14
1.2.4. Участие плазмид в переносе детерминант устойчивости к ртути 22
1.2.5. Транспозоны устойчивости к ртути 24
2. Материалы и методы 44
2.1. Отбор и доставка образцов 44
2.2. Характеристика образцов почв и пород 45
2.3. Определение валового содержания ртути в образцах 47
2.4. Питательные среды и антибиотики 47
2.5. Методы определения численности и качественного состава микроорганизмов, устойчивых к ртути 49
2.6. Выделение и идентификация чистых культур 50
2.7. Лабораторные штаммы бактерий 52
2.8. Плазмиды 53
2.9. Опыты по конъюгативному переносу плазмид 54
2.10. Метод электрофоретического разделения днк грубых лизатов 55
2.11. опыты по транспозиции 55
2.12. генно-инженерные методы 58
2.12.1. Выделение суммарной ДНК из штаммов грамотрщательных бактерий 58
2.12.2. Выделение суммарной ДНК из штаммов грамположительных бактерий 58
2.12.3. Рестрикция ДНК 59
2.12.4. Клонирование фрагментов ДНК 60
2.12.5. Трансформация Е. сої і 60
2.12.6. Электрофорез ДНК. 62
2.12.7. Элюция ДНК из легкоплавкой агарозы 62
2.12.8. Радиоактивное мечение зондов для гибридизации 63
2.12.9. Блоттинг-гибридизация ДНК-ДНК 63
2.12.10. Секвенирование ДНК. 64
2.12.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 64
3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Выделение устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений 65
3.1.1. Гарантии древности бактерий, выделяемых из мерзлоты 65
3.1.2. Создание коллекции устойчивых к ртути бактерий 69
3.2. Первичный анализ детерминант устойчивости к ртути в штаммах
мерзлотной коллекции 74
3.2.1. Определение наличия mer-оперона в мезофильных штаммах древних бактерий 74
3.2.2. Сравнительный анализ структуры тег-оперонов древних и современных штаммов термофильных бацилл 78
3.2.3. Анализ структуры тег-оперонов ацинетобактеров с помощью специфического зонда 82
3.3. Локализация детерминант устойчивости к ртути 83
3.3.1. Детерминанты устойчивости к ртути, локализованные на плазмидах 84
3.3.2. Детерминанты устойчивости к ртути, входящие в состав транспозонов 86
3.4. Исследование молекулярно-генетической структуры новых транспозонов устойчивости к ртути 94
3.4.1. «Древний» транспозон Тп5060 — безинтегронный предшественник Тп21 95
3.4.2. Ранее неизвестный транспозон Тп5042: его структура и распространение среди современных и «древних» бактерий 99
4. Заключение 107
Выводы 109
