Введение
1. Системы гетерологичной экспрессии дрожжей saccharomyces cerevisiae и ріснїа pastoris (обзор литературы) 17
1.1. Продукция ре комби нантных белков в дрожжах Saccharomyces cerevisiae 17
1.1.1. Векторы экспрессии дрожжей Saccharomyces cerevisiae 20
1.1.2. Структура промоторов дрожжей Saccharomyces cerevisiae 22
1.1.3. Промоторы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии 24
1.1.3.1. Промоторы генов, кодирующих гликолитические ферменты 24
1.1.3.2. Регулируемые промоторы 29
Промотор гена ADH2 29
Промоторы GAL-генов 31
Промотор гешРНОЗ 35
Транскрипционный активатор, кодируемый геном РН04 37
Белки регуляторы, кодируемые генами РНО80 и РН085 39
Белок, кодируемый геном РН081 40
1.1.4. Терминаторы транскрипции генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемые в биотехнологии 43
1.1.5. Зависимость уровня гетерологичной экспрессии от эффективности основных матричных процессов дрожжей Saccharomyces cerevisiae 46
1.1.5.1. Транскрипция 46
Роль DAS и DRS регуляторных последовательностей в эффективности транскрипции у дрожжей 46
Элонгация транскрипции 48
Терминация транскрипции , 48
Сплайсинг матричной РНК 49
1.1.5.2. Стабильность матричной РНК 50
1.1.5.2. Трансляция 53
Инициация трансляции 53
Элонгация трансляции 60
Терминация трансляции 62
1.1.6. Сворачивание (фолдинг) полипептидной цепи и шапероны 64
1.1.7. Постгрансляционная модификация белков 72
1.1.7.1. Удаление N-концевого метионина 72
1.1.7.2. Ацетилирование N-концевой аминокислоты 75
1.1.7.3. Фосфорилирование,гЧ-миристоилирование и фарнезилирование белков 76
1.1.8. Стабильность гетерологичных белков 77
1.1.8.1. АТФ-зависимый протеолиз с участием убиквитина 78
Сигналы деградации белков 82
1.1.8.2. Неспецифический АТФ-независимый протеолиз в вакуолях 85
1.1.9. Секреция чужеродных белков 87
1.1.9.1. Сигнальные последовательности 90
1.1.9.2. Протеолиз секреторных белков 95
1.1.9.3. Гликозилирование секреторных белков 99
1.1.9.4. Фолдинг секреторных белков 108
1.2, Продукция рекомбинантных белков в дрожжах Pichiapastoris 114
1.2.1. Особенности метаболизма метилотрофных дрожжей 116
1.2.2. Промоторы генов дрожжей Pichia pastoris, используемые в биотехнологии 119
1.2.2.1. Промотор гена АОХ1 119
1.2.2.2. Промотор гена GAP 121
1.2.2.3. Промотор TQUSLFLDJ 123
1.2.2.4. Промоторы генов PEX8,YPT1 123
1.2.3. Векторы экспрессии дрожжей Pichia pastoris 124
1.2.4. Секреция гетерологичных белков 130
1.2.4.1. Сигнальные последовательности 130
1.2.4.2. Протеолиз секреторных белков 133
1.2.4.3. Гликозилирование секреторных белков 135
1.2.4.4. Формирование дисульфидных связей и внутриклеточный транспорт секреторных белков 139
2. Материалы и методы 143
2.1. Материалы 143
2.1.1. Штаммы 143
2.1.2. Плазмиды 145
2.1.3. Условия культивирования штаммов 146
2.2. Методы 147
2.2.1. Трансформация бактерий и дрожжей 147
2.2.2. Выделение ДНК 148
2.2.3. Методы молекулярного клонирования 148
2.2.4. Полимеразная цепная реакция 148
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 149
2.2.6. Электрофорез фрагментов ДНК 149
2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 150
2.2.8. Определение концентрации белка 150
2.2.9. Электрофорез белков вПААГ 150
2.2.10. Дегликозилирование белков 150
2.2.11. Гибридизация рекомбинантных белков с моноклональными антителами 150
2.2.12. ИммуноферментныЙ анализ 151
2.2.13. Определение биологической активности ИФН и ИЛ-2 151
2.2.14. Определение активности кислых фосфатаз 152
2.2.15. Определение константы Михаэлиса 152
2.2.16. Ионообменная хроматография шозимов Кф на ДЭАЭ-целлюлозе 152
2.2.17. Гель-фильтрация Кф, рекомбинантных ИФН и HBsAg 152
2.2.18. Выделение митохондриальной фракции из клеток дрожжей 153
2.2.19. Определение активности цитохром С-оксидазы 153
2.2.20. Определение активности Р-галактозидазы 153
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 154
3.1. Создание системы экспрессии гетерологичных генов под контролем промотора гена PHOS дрожжей Saccharomyces cerevisiae 154
3.1.1. Изучение изозимного состава кислой фосфатазы дрожжей -сахаромицетов 155
3.1.2. Зависимость синтеза Кф2 от уровня белков активаторов 161
3.1.3. Создание штаммов-суперпродуцентов кислых фосфатаз 162
3.2. Клонирование генов фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка под контролем промотора гена PHOS дрожжей Saccharomyces cerevisiae 164
3.2.1. Получение рекомбинантной шгазмиды рНВІ 174
3.2.2. Влияние генотипа штамма-продуцента на продукцию фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка 178
3.2.3. Выделение фибробластного интерферона человека и иммунного интерферона быка из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae 183
3.2.4. Выяснение причин токсичности Р-ИФН человека для клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae 189
3.2.4.1. Влияние рекомбинантного Р-ИФН на синтез белка теплового шока Hsp82p 189
3.2.4.2. Изучение влияния мутацийphoSO ирко85 на жизнеспособность штаммов-продуцентов р-ИФН человека 192
3.2.4.3. Влияние рекомбинантного Р-ИФН и мутаций в гене РН085 на активность цитохром С-оксидазы 193
3.3. Клонирование генов интерферонов человека и животных, гена интерлейкина-2 человека под контролем промотора гена ЛОХ1 дрожжей Pichia pastoris 196
3.3.1. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с мутациями в генах, гомологичных генам ADE2 и РН085 дрожжей Saccharomyces cerevisiae... 197
3.3.2. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris с дизрупцией гена РЕР4 201
3.3.3. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих Р-ИФН человека 202
3.3.3.1. Создание вектора экспрессии pHIF 202
3.3.3.2. Определение нуклеотидной последовательности амплиф шифрованного renaIFNB2 человека 206
3.3.3.3. Создание вектора экспрессии pHIF2, обеспечивающего синтез нативного р-ИФН человека 208
3.3.3.4. Получение интегрантов дрожжей, несущих плазмиды pHIF и pHIF2 210
3.3.3.5. Оценка продуктивности штаммов 4-GS115/pHIF H4-GS115/pHIF2 212
3.3.3.6. Определение углеводного компонента рекомбинантного р-ИФН человека, секретируемого дрожжами Pichia pastoris 213
3.3.4. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающего синтез и
внутриклеточное накопление рекомбинантного Р-ИФН человека 215
3.3.4.1. Создание вектора экспрессии pHIVB 215
3.3.4.2. Оценка уровня продукции рекомбинантного р-ИФН человека штаммом 4-GS115/pHIVB 217
3.3.5. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих аІб-ИФН человека 219
3.3.5.1. Создание вектора экспрессии pHIN 221
3.3.5.2. Получение штамма-продуцента а16-ИФН человека и оценка его продуктивности 221
3.3.6. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих у-ИФН быка 221
3.3.6.1. Создание вектора экспрессии pPIC9(IFN-y) 221
3.3.6.2. Получение штамма-продуцента у-ИФН быка и оценка его продуктивности 221
3.3.7. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, обеспечивающих синтез и внутриклеточное накопление у-ИФН быка 221
3.3.8. Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris, синтезирующих и секретирующих интерлейкин-2 человека 221
3.3.9. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных секреторных интерферонов 221
3.3.10. Разработка схемы очистки рекомбинантных а16-ИФН и р-ИФН
человека, секретируемых клетками дрожжей Pichia pastoris 221
3,4, Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris - продуцентов синтаксина Б, пресинаптического глутаматного рецептора мозга крысы 221
3.4Л. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление синтаксина Б 221
3.4.2. Получение интегрантов дрожжей Pichia pastoris, содержащих в геноме ген STX1B и оценка уровня продукции рекомбинантного синтаксина Б 221
3.4.3. Получение штаммов дрожжей Pichia pastoris, секретирующих рекомбинантный синтаксинБ 221
3.5. Клонирование гена, кодирующего структуру основного белка поверхностного антигена вируса гепатита В, под контролем промотора гена АОХ1 221
3.5.1. Конструирование вектора экспрессии, обеспечивающего секрецию рекомбинантного HBsAg adw и ayw серотипов 221
3.5.2. Получение штаммов дрожжей Pichiapastoris, секретирующих рекомбинантный HBsAg 221
3.5.3. Получение штамма дрожжей Pichiapastoris, обеспечивающего синтез и внутриклеточное накопление рекомбинантного HBsAg 221
4. Обсуждение 221
Влияние структуры вектора экспрессии и числа копий клонированного гена на уровень продукции гетерологичных белков 221
Влияние структуры лидерной области мРНК и присутствия редких кодонов на продукцию гетерологичных белков 221
Посттрансляционная модификация гетерологичных белков 221
Влияние особенностей метаболизма дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris на фолдинг рекомбинантных белков 221
Стабильность гетерологичных белков 221
Влияние гетерологичных белков на жизнедеятельность клетки дрожжей 221
Секреция гетерологичных белков 221
Продукция синтаксина Б и HBsAg 221
Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов 221
Выделение и очистка гетерологичных белков 221
Заключение 221
Выводы 221
Список литературы
