Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Общие принципы регенерации ткани 10
1.2. Мезенхимные стромальные клетки (МСК): определение и общие положения 11
1.3. Источники получения МСК 14
1.4. Роль МСК в регенерации и репарации: секреторные свойства 16
1.5. Взаимодействие МСК и клеток иммунной системы
1.5.1. Регуляция МСК с участием факторов, секретируемых клетками и ммунной си стемы 24
1.5.2. Влияние МСК на развитие иммунного ответа: иммуносупрессивные свой ства 26
1.5.3. Взаимодействие МСК с макрофагами
1.6. Моделирование воспалительного окружения с помощью THP-1 32
1.7. Миграция МСК in vitro и in vivo
1.7.1. Общие положения 33
1.7.2. Механизм хоуминга МСК 34
1.7.3. Хемотаксис МСК: хемокины и факторы роста 35
1.7.4. Гаптотаксис: роль внеклеточного матрикса 47
2. Материалы и методы 53
2.1. Культивируемые клетки 53
2.2. Выделение мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани 53
2.3. Иммунофенотипирование МСК 54
2.4. Выделение фибробластов дермы человека 54
2.5. Запуск макрофагальной дифференцировки THP-1 и анализ профиля экспрессии макрофагов 55
2.6. Культивирование МСК в среде, кондиционированной THP-1 55
2.7. Бесконтактное сокультивирование МСК с макрофагами или фибробластами 56
2.8. Выделение РНК из клеток 56
2.9. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени 57
2.10. Анализ профиля экспрессии генов с применением системы RT2 Profiler PCR Array 59
2.11. Обработка результатов количественного анализа уровня экспрессии генов 59
2.12. Коллекционирование кондиционированной среды 59
2.13. Анализ уровня белков в кондиционированной среде методом ИФА 60
2.14. Scratch assay (модель раны монослоя) 61
2.15. Миграция в системе xCELLigence 62
2.16. Иммуноцитохимия 64
2.17. Электрофорез белков и иммуноблоттинг 66
2.18. Статистическая обработка 67
3. Результаты 68
3.1. Иммунофенотипирование МСК 68
3.2. Оценка профиля экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных факторов клетками THP-1 при макрофагальной дифференцировке 69
3.3. Анализ уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов, секретируемых макрофагами 70
3.4. Анализ профиля экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных факторов МСК после сокультивирования 72
3.5. Анализ количества провоспалительных интерлейкинов в среде сокультивирования МСК и макрофагов 74
3.6. Анализ профиля экспрессии генов хемокинов и их рецепторов МСК после сокультивирования с помощью системы RT2 Profiler PCR Array 75
2.6.1. Экспрессия генов хемокинов 75
2.6.2. Экспрессия генов рецепторов к хемокинам 77
3.7. Анализ уровня хемокинов в среде сокультивирования МСК и макрофагов 79
3.8. Анализ экспрессии генов металлопротеиназ и системы урокиназы, отвечающих за клеточную миграцию, в МСК после сокультивирования 81
3.9. Изменение морфологии МСК при сокультивировании с макрофагами 3.10. Исследование изменений фокальных контактов МСК в условиях сокультивирования с макрофагами 85
3.11. Подвижность МСК в среде кондиционированной макрофагами (ненаправленная миграция) 86
3.12. Зависимость скорости направленной миграции МСК в системе xCELLigence от вида матрикса 87
3.13. Направленная миграция МСК на хемокины и факторы роста 88 3.14. Предварительное сокультивирование с макрофагами не влияет на скорость хемотаксиса МСК по градиенту хемокинов 89
3.15. Предварительное сокультивирование с макрофагами увеличивает скорость направленной миграции МСК на PDGF-BB в системе xCELLigence. 90
3.16. При сокультивировании с макрофагами в МСК возрастает уровень экспрессии гена PDGFR и его белка 91
3.17. Блокирующие антитела к PDGF-BB не влияют на скорость миграции МСК через фибронектин 92
3.18. Ингибиторы сигнального каскада PDGFR снижают скорость направленной миграции МСК в системе xCELLigence 93
3.19. При сокультивировании с макрофагами в МСК возрастает уровень экспрессии генов интегринов 3, 4, 5, 1 и уровень белка - интегрина 1 (CD29) 95
3.20. При связывании МСК с фибронектином увеличивается уровень фосфорилированного Akt под действием макрофагов 97
3.21. При сокультивировании МСК с макрофагами изменяется уровень экспрессии генов белков внеклеточного матрикса 98
4. Обсуждение 100
Заключение 116
Выводы 118
Список сокращений 119
Список литературы
