Введение ...............................................................................................………………………………...6
Глава 1. Обзор литературы..................................................................................................................12
1.1. Современные представления о системах ТА у бактерий ......................................................... 12
1.1.1. Многообразие систем токсин-антитоксин у прокариот ........................................................... 12
1.1.1.1. Системы ТА I типа............................................................................................................. 13
1.1.1.2. Системы ТА II типа............................................................................................................ 14
1.1.1.3. Системы ТА III типа .......................................................................................................... 18
1.1.1.4. Системы ТА IV типа .......................................................................................................... 19
1.1.1.5. Системы ТА V типа ........................................................................................................... 20
1.1.1.6. Системы ТА VI типа .......................................................................................................... 22
1.1.1.7. Системы ТА VII типа......................................................................................................... 23
1.1.1.8. Системы ТА VIII типа........................................................................................................ 24
1.1.2. Функции систем ТА II типа....................................................................................................... 25
1.1.3. Понятие о стресс-адаптивной функции .................................................................................... 28
1.1.4. Механизмы регуляции функционирования систем ТА ............................................................ 33
1.1.4.1. Транскрипционный уровень регуляции................................................................................... 33
1.2.4.2. Регуляция на уровне трансляции ............................................................................................. 35
1.1.4.1. Посттрансляционный уровень регуляции ......................................................................... 35
1.1.5. Функционирование систем ТА как единой сети....................................................................... 35
1.1.6. Вклад систем ТА в толерантность и устойчивость к антибиотикам у бактерий ..................... 36
1.2. Микобактериальные системы ТА .................................................................................................. 37
1.2.1. Системы ТА у микобактерий, их количество и распространённость в геномах различных
представителей рода Mycobacterium .................................................................................................... 37
1.2.2. Системы ТА у M. tuberculosis ..................................................................................................... 38
1.2.2.1. Система ТА VapBC46 как один из ключевых регуляторов ответа M. tuberculosis на
стрессовые воздействия ........................................................................................................................ 42
1.2.2.2. Мутация в гене vapC46 C113G характерна для высоковирулентной сублинии Beijing-B0/W148
44
1.2.3. Системы ТА у M. smegmatis........................................................................................................ 45
1.2.4. Система ТА VapBC2 M. smegmatis, её роль в регуляции роста и ответа бактериальных клеток
на стрессовые воздействия ................................................................................................................... 46
1.3. Участие систем ТА в регуляции фолдинга белков и функционирования оперона dosR.............. 49
1.3.1. Участие систем ТА в регуляции фолдинга белков ..................................................................... 49
1.3.2. Участие систем ТА в регуляции оперона dosR........................................................................... 52
1.4. Прикладное применение систем ТА.............................................................................................53
1.4.1. Применение систем ТА в генетической инженерии................................................................... 53
1.4.2. Применение систем ТА в терапии инфекционных заболеваний................................................ 55
3
1.4.2.1. Системы ТА в антибактериальной терапии............................................................................. 55
1.4.2.2. Системы ТА в противовирусной терапии................................................................................ 57
Глава 2. Материалы и методы .............................................................................................................. 60
2.1. Работа с бактериальными культурами .......................................................................... 60
2.1.1. Бактериальные штаммы, использованные в работе ................................................................. 60
2.1.2. Среды и антибиотики, использованные в работе ....................................................................... 61
2.1.3. Получение химически-компетентных клеток E. coli................................................................ 62
2.1.4. Трансформация компетентных клеток E. coli........................................................................... 63
2.1.5. Получение электро-компетентных клеток M. smegmatis.......................................................... 63
2.1.6. Электротрансформация компетентных клеток M. smegmatis.................................................. 63
2.1.7. Оценка скорости роста клеток M. smegmatis в жидкой среде .................................................. 64
2.1.8. Оценка лекарственной чувствительности штаммов M. smegmatis методом определения
минимальных ингибирующих концентраций антибиотиков (МИК)................................................... 64
2.1.9. Оценка жизнеспособности трансформантов M. smegmatis, несущих ген vapC46 и его
мутантный вариант vapC46 C113G, в условиях стресса, связанного с лимитированием источников
азота и углерода .................................................................................................................................... 65
2.1.10. Проведение окислительного стресса......................................................................................... 66
2.2. Работа с нуклеиновыми кислотами........................................................................................... 67
2.2.1. Плазмидные векторы, использованные в работе...................................................................... 67
2.2.2. Олигонуклеотиды, использованные в работе ........................................................................... 72
2.2.3. Амплификация ДНК.................................................................................................................. 74
2.2.4. Получение делеции модуля vapBC2 M. smegmatis ................................................................... 76
2.2.5. Выделение и очистка ДНК........................................................................................................ 79
2.2.6. Выделение и очистка плазмидной ДНК.................................................................................... 79
2.2.7. Реакция рестрикции................................................................................................................... 79
2.2.8. Реакция лигирования................................................................................................................. 79
2.2.9. Горизонтальный электрофорез ДНК и РНК в агарозном геле ................................................. 79
2.2.10. Выделение РНК ......................................................................................................................... 80
2.2.11. Проведение реакции обратной транскрипции .......................................................................... 80
2.2.12. Амплификация ДНК в режиме реального времени .................................................................. 81
2.3. Работа с белками........................................................................................................................ 82
2.3.1. Выделение белков VapC46 и VapC2 из клеточного лизата ...................................................... 82
2.3.2. Выделение белков VapC46 w.t. и VapC46 mut из телец включения ........................................ 83
2.3.3. Выделение белка VapC2 из растворимой фракции .................................................................. 84
2.3.4. Постановка вертикального электрофореза в полиакриламидном геле .................................... 84
2.3.5. Исследование рибонуклеазной активности .............................................................................. 86
2.3.6. Исследование шаперонной активности белка VapC2 с использованием β-галактозидазы..... 87
2.3.7. Исследование шаперонной активности белка VapC2 с использованием люциферазы
светлячка Photinus pyralis..................................................................................................................... 89
4
2.4. Биоинформатический анализ .................................................................................................... 91
2.5. Статистическая обработка результатов .................................................................................... 91
Глава 3. Результаты и обсуждение ......................................................................................................92
3.1. Исследование стресс-адаптивных функций модуля vapBC46 M. tuberculosis.............................. 92
3.1.1. Биоинформатический анализ влияния мутации в гене vapC46 на функцию кодируемого им
токсина .................................................................................................................................................. 92
3.1.2. Биоинформатический анализ влияния мутации C113G vapC46 на структуру токсина VapC4692
3.1.3. Анализ влияния гена vapC46 в составе вектора pKW08-MCS-Int и его мутантного варианта
на рост клеток-трансформантов M. smegmatis..................................................................................... 93
3.1.4. Оценка влияния гена vapC46 дикого типа и его мутантного варианта на лекарственную
чувствительность M. smegmatis............................................................................................................ 94
3.1.5. Исследование влияния vapC46 на рост и выживаемость трансформантов M. smegmatis в
условиях окислительного стресса......................................................................................................... 97
3.1.6. Анализ влияния мутации в гене vapC46 на рост трансформантов M. smegmatis в условиях
лимитирования источников азота и углерода .................................................................................... 104
3.1.7. Выделение белка VapC46 дикого типа и его мутантного варианта для определения РНКазной
активности........................................................................................................................................... 107
3.1.8. Оценка влияния мутации на РНКазную активность белка VapC46....................................... 110
Заключение к разделу 3.1.................................................................................................................... 111
3.2. Исследование стресс-адаптивных функций модуля vapBC2 M. smegmatis ........................... 115
3.2.1. Анализ влияния модуля vapBC2 на рост клеток M. smegmatis в отсутствие стрессовых
воздействий ......................................................................................................................................... 115
3.2.2. Анализ влияния модуля vapBC2 на чувствительность клеток M. smegmatis к антибиотикам
116
3.2.3. Анализ влияния модуля vapBC2 M. smegmatis на рост и выживаемость в условиях
окислительного стресса ...................................................................................................................... 117
3.2.4. Биоинформатический анализ предполагаемых взаимодействий компонентов системы ТА
VapBC2 с другими клеточными белками........................................................................................... 121
3.2.5. Анализ влияния модуля vapBC2 на уровень экспрессии генов MSMEG_6764, MSMEG_5244 и
MSMEG_3944 ...................................................................................................................................... 122
3.2.6. Анализ влияния модуля vapBC2 M. smegmatis на рост в средах с минимальным содержанием
глицерина ............................................................................................................................................ 124
3.2.7. Выделение белка VapC2 для дальнейшей оценки его РНКазной и шаперонной активности126
3.2.8. Оценка РНКазной активности белка VapC2........................................................................... 127
3.2.9. Определение шаперонной активности белка VapC2 с использованием β-галактозидазы .... 128
3.2.10. Определение шаперонной активности белка VapC2 с использованием люциферазы светлячка
129
Заключение к разделу 3.2.................................................................................................................... 130
Заключение.......................................................................................................................................... 133
Выводы................................................................................................................................................ 135
Список сокращений ............................................................................................................................ 136
Список терминов................................................................................................................................. 137
5
Список литературы ............................................................................................................................. 138
Благодарности ..................................................................................................................................... 158
