Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .8
1.1. Распространенность белков PII в природе 8
1.2. PII бактерий
1.2.1. Грамотрицательные бактерии 9
1.2.2. Грамположительные бактерии
1.3. PII архей 28
1.4. PII эукариот 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования и условия культивирования 38
2.2. Получение прегамет и гамет Chlamydomonas reinhardtii .39
2.3. Определение концентрации хлорофилла .39
2.4. Выделение тотальной РНК 40
2.5. Метод ПЦР, OT-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени .40
2.6. Клонирование и секвенирование ДНК-фрагментов 43
2.7. Выделение тотального белка и определение его концентрации 44
2.8. Вестерн-блоттинг .44
2.9. Изоляция хлоропластов из клеток Chlamydomonas reinhardtii 45
2.10. Определение активности глутаминсинтетазы (GS) 46
2.11. Определение внутриклеточного содержания свободного аргинина 46
2.12. Определение содержания глутамата в среде .47
2.13. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных белков 47
2.14. Гель-фильтрация 49
2.15. Метод оценки активности фермента NAGK .50
ГЛАВА 3. Результаты 52
3.1. Характеристика белка PII Chlamydomonas reinhardtii (CrPII) .52
3.1.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CrPII .52
3.1.2. Иммунологическая идентификация CrPII 54
3.1.3. Транскрипция гена CrGLB1, кодирующего белок CrPII .55
3.1.4. Олигомерная структура CrPII 59
3.2. Идентификация и характеристика белка PII Chlorella variabilis (CvPII) 60
3.2.1. Биоинформационный анализ первичной последовательности CvPII .60
3.2.2. Иммунологическая идентификация CvPII 63
3.2.3. Определение последовательности кодирующей цепи ДНК CvPII 64
3.2.4. Транскрипция гена CvGLB1, кодирующего белок CvPII 67
3.2.5. Олигомерная структура CvPII 73
3.3. Характеристика N-ацетил-L-глутаматкиназ (NAGK) C.reinhardtii и C.variabilis 74
3.3.1. Биоинформационный анализ первичных последовательностей CvNAGK и CrNAGK .74
3.3.2. Олигомерная структура CvNAGK и CrNAGK .77
3.4. Взаимодействие PII-белков с N-ацетил-L-глутаматкиназами .78
3.4.1. Формирование комплексов PII-NAGK 78
3.4.2. Действие PII на активность NAGK 79
3.4.2.1. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGK
одноклеточных зеленых водорослей .79
3.4.2.2. Глутамин-зависимая регуляция белками PII активности NAGK
растений .90
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов .93
4.1. Структура и регуляция белков PII Chlamydomonas reinhardtii и Chlorella variabilis 93
4.2. N-ацетил-L-глутаматкиназы – мишени белков PII фотосинтезирующих организмов .96
Заключение 101
Выводы .104
Благодарности .105
Список сокращений 106
Список литературы .
