Введение
І.Обзор литературы
1.1. Общая характеристика семейства малых белков теплового шока 10
1.2. Строение малых белков теплового шока 13
1.3. Функции малых белков теплового шока
1.3.1. Шаперошшя активность sHsp 20
1.3.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина и регуляция динамики цитоскелета 25
1.3.3. Участие в регуляции апоптоза 28
1.3.4. Роль в развитии нейродегенеративных заболеваний и катаракты 33
II. Материалы и методы
2.1. Препаративные методы
2.1.1. Экспрессия и выделение Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта 40
2.1.2. Выделение актина 42
2.2. Определение тканевого распределения Hsp22 43
2.3. Методы, использованные для исследования структуры Hsp22
2.3.1. Измерение кругового дихроизма 43
2.3.2. Гель-фильтрация 44
2.3.3. Нативный электрофорез 44
2.3.4. Использование методов химической модификации для изучения четвертичной структуры
2.3.4.1 Модификация диметилсуберимидатом (ДМС) 46
2.3.4.2. Образование дисульфидных связей 46
2.3.5.1 Іеравновесное аналитическое ультрацентрифугирование 46
2.4. Определение протеинкиназной активности 47
2.5. Методы, использованные при изучении взаимодействия Hsp22 с нативным актином
2.5.1. Метод флуоресцентной спектроскопии 48
2.5.2 Метод ультрацентрифугирования 49
2.6. Методы, использованные при изучении взаимодействия 1 lsp22 с Hsp27 и Hsp20
2.6.1. Гель-фильтрация 49
2.6.2. Светорассеяние 50
2.7. Определение шаперонной активности
2.7.1. Определение шаперонной активности с инсулином 51
2.7.2. Определение шаперонной активности с алкогольдегидрогеназой 51
2.7.3. Определение шаперонной активности с роданазой 52
2.7.4. Влияние Hsp22 на агрегацию денатурированного актина 52
2.8. Некоторые аналитические методы
2.8.1. Определение концентрации белка
2.8.1.1. Спектрофотометрический метод 52
2.8.1.2. Метод Брэдфорд 53
2.8.2. S DS-Элскгрофорез в ПААГ 5 3
2.8.3. Иммуноблоттинг 54
III. Результаты исследований
3.1. Разработка метода выделения рекомбинантного Hsp22 человека из E.Coli 56
3.2. Тканевое распределение Hsp22 61
3.3. Структура и некоторые физико-химические свойства Hsp22
3.3.1 Доричная и третичная структура 64
3-3.2 Четвертичная структура 67
3.3.3 Влияние рН на стабильность и структуру Н.чр22 и его К141Е-мутапта 76
3.4. Определение протсинкиназиой активности Hsp22 79
3.5. Hsp22 не ингибирует полимеризацию актина 82
3.6. Взаимодействие I lsp22 с другими малыми белками теплового шока 84
3.7. Сравнение шаперонной активности 1 lsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта 91
IV. Обсуждение результатов
4.1. Выделение и характеристика некоторых физико-химических свойствHsp22 100
4.2. Протеинкиназная активность I Isp22 106
4.3. Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие Hsp22 в регуляции полимеризации актина 108
4.4. Шапсронная активность Hsp22 111
V. Выводы 114
Список литературы 115
