Введение
Обзор литературы 9
1. Структура и свойства малых Hsp 9
1.1. Общие сведения о малых Hsp 9
1.2. Структура малых Hsp 12
1.3. Образование гетероолигомериых комплексов 18
1.4. Фосфорилирование малых Hsp 22
1.5. Шапероішая активность 25
2. Возможная функциональная роль Hsp20 29
2.1. Участие Hsp20 в предотвращении агрегации тромбоцитов 29
2.2. Возможное участие Hsp20 в регуляции метаболизма глюкозы под действием инсулина 30
2.3. Регуляция сократительной активности гладких мышц и возможное участие Hsp20 в этом процессе 31
2.4. Возможное участие Hsp20 в регуляции сократительной активности и апоптозе кардиомиоцитов 36
Материалы и методы 39
1. Препаративные методы 39
1.1. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантных Hsp20 и Hsp27 человека и их точечных мутантов с заменами, имитирующими фосфорилирование (Hsp20D и Hsp27 3D) 39
1.1.1 Получение препарата рекомбинантного Hsp20 дикого типа (Hsp20WT) 39
1.1.2. Получение высокоочищешюго препарата рекомбинантного Hsp20 с заменой остатка Serl6 на остаток аспарагиновой кислоты (Hsp20D) 42
1.1.3. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантного Hsp27 дикого типа (Hsp27WT) и его мутанта с заменами остатков SerlS, Ser78, Ser82 на остатки аспарагиновой кислоты (Hsp27 3D) 43
1.2. Выделение актина из ацетонового порошка скелетных мышц кролика... 44
1.3. Выделение миофибрилл из скелетной и сердечной мышц человека или гладких мышц птиц 45
2. Методы, использованные для изучения свойств Hsp20 45
2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом гель-фильтрации. 45
2.2. Определение молекулярной массы Hsp20 методом нативного электрофореза в градиенте пористости геля 46
2.3. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом неравновесного аналитического ультрацентрифугирования 48
2.4. Изучение влияния рН на вторичную структуру Hsp20 методом кругового дихроизма (КД) 48
2.5. Изучение олигомерного состояния Hsp20 методом химического «сшивания» 49
3. Определение шаперонной активности малых Hsp 50
3.1. Влияние малых Hsp на агрегацию инсулина 51
3.2. Влияние малых Hsp на агрегацию алкогольдегидрогеназы 51
3.3. Влияние малых Hsp на агрегацию термически денатурированного актина 52
4. Методы, использованные для изучения взаимодействия Hsp20 с другими белками 52
4.1. Изучение взаимодействия Hsp20 и Hsp27 методом гель-фильтрации 52
4.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина 53
4.2.1 Метод ультрацентрифугирования 53
4.2.2 Метод флуоресцентной спектроскопии 53
4.3. Изучение взаимодействия Hsp20 с комплексами актин-связывающих белков с F-актином 54
4.3.1 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-тропомиозин 54
4.3.2 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-ос-актинин 55
4.3.3 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-кальпонин 55
4.3.4 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл 56
5. Некоторые аналитические методы 56
5.1. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS 56
5.2. Изоэлектрофокусирование в денатурирующих условиях 57
5.3. Вестерн-блоттинг 58
5.4. Определение концентрации белка 59
5.4.1 Спектрофотометрический метод 59
5.4.2 Метод Брэдфорд 59
6. Состав и обозначение буферных растворов/ использованных в работе 60
Результаты исследования 61
1. Выделение Hsp20 и его S16D мутанта и определение их шаперонной активности 61
1.1. Выделение Hsp20 61
1.2. Определение шаперонной активности Hsp20 66
2. Изучение свойств Hsp20 70
2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20 70
2.1.1 Влияние концентрации на олигомерное состояние Hsp20WT 70
2.1.2 Влияние мутации, имитирующей фосфорилирование Serl6, на олигомерное состояние Hsp20 79
2.2. Влияние рН на структуру и свойства Hsp20 84
2.2.1 Влияние рН на шаперонную активность Hsp20 84
2.2.2 Влияние рН на олигомерное состояние Hsp20 90
2.2.3 Влияние рН на вторичную структуру Hsp20 92
2.3. Влияние Hsp20 на агрегацию термически денатурированного актина,... 94
3. Взаимодействие Hsp20 с другими белками 97
3.1. Образование гетероолигомерных комплексов cHsp27 97
3.2. Взаимодействие Hsp20 и актина 103
3.2.1 Влияние Hsp20 на скорость и степень полимеризации G-актина... 104
3.2.2 Анализ взаимодействия Hsp20 с F-актином и комплексами F-актин-актин-связывающий белок , 106
3.2.3 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл 109
Обсуждение результатов 113
1. Некоторые физико-химические свойства Hsp20 113
1.1. Олигомерное состояние и шаперонная активность Hsp20 113
1.2. Влияние рН на олигомерное состояние и шаперонную активность Hsp20. 120
2. Образование гетероолигомерных комплексов Hsp20 и Hsp27 124
3. Взаимодействие Hsp20 и актина 126
Выводы 130
Список литературы 131
