Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1. Физиолого-биохимические характеристики бактерий рода Sphaerotilus 10
1.1.1. Эколого-морфологические характеристики бактерий 10
1.1.2. Характеристика Sphaerotilus па tans 12
1.2. Физико-химические и кинетические свойства малатдегидрогеназы 15
1.2.1. Способы получение высокоочищенных препаратов 15
1.2.2. Общая характеристика каталитического действия 17
1.2.3. Кинетические параметры 18
1.2.4. Влияние концентрации ионов водорода 19
1.2.5. Влияние интермедиатов и ионов 21
1.2.6. Влияние температуры на активность МДГ 24
1.2.6.1. Температурный оптимум 24
1.2.6.2. Термостабильность МДГ 25
1.3. Атомно-силовая микроскопия 31
1.3.1. Исследование биообъектов и макромолекул 31
1.3.2. Основной принцип работы атомно-силового микроскопа и режимы сканирования 35
1.4. Молекулярная абсорбционная спектроскопия электронных переходов 38
1.4.1. Спектральные характеристики ароматических аминокислот в УФ- области 39
1.4.2. Аминокислотный состав малатдегидрогеназы 42
ГЛАВА 2. CLASS Экспериментальная част CLASS ь 50
2.1. Объект и методы исследования 50
2.1.1. Объект исследования 50
2.1.2. Методы исследования 5 0
2.1.2.1. Состав питательной среды для культивирования 50
2.1.2.2. Определение активности фермента 51
2.1.2.3. Определение общего количества белка 52
2.1.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы 53
2.1.2.5. Электрофоретические исследования 54
2.1.2.5.1. Аналитический электрофорез 54
2.1.2.5.2.Определение гомогенности ферментативных препаратов 55
2.1.2.5.3.Специфическое проявление МДГ 55
2.1.2.5.4.Определение молекулярной массы субъединиц 55
2.1.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента 56
2.1.2.7. Ингибиторный анализ 57
2.1.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляция активности малатдегидрогеназы 57
2.1.2.9. Определение структурных особенностей МДГ методом атомно-силовой микроскопии 58
2.1.2.10. Регистрация спектров поглощения ароматических аминокислот малатдегидрогеназы 59
2.1.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 59
2.2. Полученные результаты и их обсуждение 61
2.2.1. Исследование изоферментного состава малатдегидрогеназы у бактерий Sphaerotilus natans 61
2.2.2. Очистка малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий 63
2.2.3. Определение гомогенности ферментных препаратов 69
2.2.4. Четвертичная структура МДГ из изучаемых бактерий 72
2.2.4.1. Определение молекулярной массы нативного фермента 73
2.2.4.2. Определение субъединичного строения МДГ 73
2.2.5. Кинетические и регуляторные характеристики малатдегидрогеназы 77
2.2.5.1. Влияние концентрации ионов водорода 77
2.2.5.2. Определение константы Михаэлиса 79
2.2.5.3. Определение константы субстратного ингибирования 85
2.2.5.4. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность МДГ 85
2.2.5.5. Влияние температуры 90
2.2.5.5.1.Температурный оптимум 90
2.2.5.5.2.Термостабильность МДГ 93
2.2.6. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ 95
2.2.7. Топография поверхности молекулы фермента 98
2.2.8. Сравнительный анализ спектров поглощения МДГ 103
Заключение 111
Выводы 115
Список литературы 118
