Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Структура и функции церулоплазмина 12
1.2. Участие белковых факторов нейтрофилов и эозинофилов в воспалительных реакциях 27
1.2.1. Участники респираторного взрыва нейтрофилов и эозинофилов: оксидазы и пероксидазы 29
1.2.2. Протеолитические ферменты лейкоцитов 40
1.2.3. Железо-связывающие белки лейкоцитов 44
1.2.4. Белки лейкоцитов, влияющие на стабильность мембраны микроорганизмов 48
1.2.5. Окислительная модификация липопротеинов, сопровождающая воспаление 49
1.3. Заключение по обзору литературы 55
2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Реактивы, использованные в работе 57
2.1.1. Получение опсонизированного зимозана 58
2.1.2. Получение бромциана 58
2.2. Клеточные методы 59
2.2.1. Выделение нейтрофилов 59
2.2.2. Измерение индекса фагоцитоза нейтрофилов 59
2.2.3. Измерение продукции супероксидных анион-радикалов нейтрофилами 59
2.2.4. Измерение продукции пероксида водорода нейтрофилами 60
2.2.5. Анализ проатерогенности липопротеинов низкой плотности при культивировании с моноцитами 60
2.3. Хроматографические методы 61
2.3.1. Синтез сорбентов 61
2.3.1.1 Иммобилизация соединений, содержащих №Ї2-группу, на BrCN-активированной Сефарозе и агарозе 61
2.3.1.2. Получение аминоэтил-(АЕ)-агарозы 62
2.3.2. Гель-фильтрация 62
2.3.3. Аффинная хроматография 62
2.3.3.1. Аффинная хроматография экстракта лейкоцитов на иммобилизованном церулоплазмине 62
2.3.3.2. Аффинная хроматография пероксидазы эозинофилов на иммобилизованном церулоплазмине 62
2.3.3.3. Измерение константы диссоциации комплекса церулоплазмин-азуроцидин 63
2.3.3.4. Аффинная хроматография липопротеинов низкой плотности на иммобилизованной миелопероксидазе 63
2.4. Спектральные методы исследования 63
2.4.1. Спектрофотометрия 63
2.4.2. Фотонная корреляционная спектроскопия 64
2.4.3. Электронный парамагнитный резонанс 65
2.4.4. Хемилюминесценция 65
2.5. Измерение активности ферментов 66
2.5.1. Измерение активности миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов 66
2.5.1.1. Измерение пероксидазной активности 66
2.5.1.2. Кинетика пероксидазной активности миелопероксидазы 67
2.5.1.3. Кинетика пероксидазной активности пероксидазы эозинофилов 67
2.5.1.4. (Псевдо)галогенирующая активность миелопероксидазы и пероксидазы эозинофилов 67
2.5.1.5. Измерение утилизации пероксида водорода миелопероксидазой с помощью сенсора на основе пленок берлинской лазури 68
2.5.2. Измерение оксидазной активности церулоплазмина 68
2.5.2.1. Пара-фенилендиамин-оксидазная активность церулоплазмина 68
2.5.2.2. Кинетика пара-фенилендиамин-оксидазной активности церулоплазмина 69
2.5.2.3. Кинетика ферроксидазной активности церулоплазмина 69
2.5.2.4. Измерение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина 69
2.5.3. Измерение активности эластазы и протеиназы 3 70
2.5.3.1. Кинетика активности эластазы и протеиназы 3 70
2.5.4. Измерение активности катепсина G 70
2.5.4.1. Кинетика активности катепсина G 70
2.5.5. Измерение активности тромбина 70
2.5.6. Измерение активности 5-липоксигеназы 71
2.6. Электрофоретические методы 71
2.6.1. Диск-электрофорез в щелочной системе 71
2.6.1.1. Выявление о-дианизидин-оксидазной активности после электрофореза 72
2.6.2. Диск-электрофорез в кислой системе 72
2.6.2.1. Выявление пероксидазной активности после электрофореза 72
2.6.3. Электрофорез в кислой системе в присутствии мочевины 73
2.6.4. Диск-электрофорез в нейтральной системе 73
2.6.5. Электрофорез в щелочной системе в присутствии SDS 73
2.6.5.1. Выявление желатиназной активности in situ 74
2.6.5.2. Выявление пероксидазной активности in situ 74
2.6.6. Электрофорез в присутствии SDS в высокомолярной Tris-буферной системе 74
2.6.7. Электрофорез в четырехслойном полиакриламидном геле 75
2.6.8. Масс-спектрометрия фрагментов трипсинолиза после электрофореза 75
2.6.9. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности 76
2.7. Получение белковых препаратов 76
2.7.1. Выделение церулоплазмина плазмы крови 76
2.7.1.1. Выделение церулоплазмина с помощью протамин-Сефарозы 76
2.7.1.2. Выделение церулоплазмина с помощью неомицин-агарозы 77
2.7.1.3. Выделение церулоплазмина на АЕ-агарозе 78
2.7.2. Выделение лактоферрина грудного молока 79
2.7.3. Выделение белков нейтрофильных лейкоцитов 79
2.7.3.1. Выделение миелопероксидазы 80
2.7.3.2. Выделение серпроцидинов 80
2.7.3.3. Выделение СТАВ-миелопероксидазы и СТАВ-пероксидазы эозинофилов 81
2.7.4. Выделение липопротеинов плазмы крови 81
2.8. Иммунохимические методы 82
2.8.1. Подготовка антигенов для иммунизации 82
2.8.2. Иммунизация кроликов и крыс 82
2.8.3. Выделение иммуноглобулинов G сыворотки 82
2.8.4. Двойная радиальная иммунодиффузия 83
2.8.5. Ракетный иммуноэлектрофорез 83
2.8.6. Вестерн-блоттинг 84
2.8.7. Твердофазный иммуноферментный анализ 85
2.8.7.1. Сэндвич иммуноферментный анализ миелопероксидазы 85
2.8.7.2. Конкурентный иммуноферментный анализ церулоплазмина 86
2.8.7.3. Иммуноферментный анализ азуроцидина 86
2.8.8. Иммунопреципитация церулоплазмина из плазмы крови 87
2.9. Антимикробная активность лактоферрина и миелопероксидазы 87
2.10. Модификация белков и липопротеинов низкой плотности 87
2.10.1. Получение апо-формы церулоплазмина 87
2.10.2. Получение протеолизованного церулоплазмина 88
2.10.3. Получение лактоферрина, насыщенного железом и медью 88
2.10.4. Модификация церулоплазмина окислителями 88
2.10.5. Модификация липопротеинов низкой плотности окислителями 89
2.11. Анализ трехмерной структуры белков и их комплексов 89
2.12. Статистическая обработка результатов 89
2.13. Получение образцов от здоровых доноров, пациентов с воспалительными заболеваниями и лабораторных животных 90
3. Результаты 91
3.1. Структура комплексов, формируемых при взаимодействии церулоплазмина с лактоферрином и миелопероксидазой 91
3.1.1. Исследование методом гель-фильтрации 91
3.1.2. Исследование методом фотонной корреляционной спектроскопии 93
3.2. Идентификация белков лейкоцитов, взаимодействующих с церулоплазмином 95
3.2.1. Анализ белков экстракта лейкоцитов, сорбирующихся на иммобилизованном церулоплазмине 96
3.2.2. Анализ комплексов церулоплазмина, выделяемых при очистке его препаратов 97
3.2.3. Идентификация компонентов комплексов, обнаруживаемых у пациентов при воспалительных процессах 100
3.2.3.1. Идентификация компонентов комплексов ЦП, содержащих МПО и апоВ-100- содержащие липопротеины 101
3.3. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами и пероксидазой эозинофилов 102
3.3.1. Изучение взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами 102
3.3.2. Изучение взаимодействия церулоплазмина и пероксидазы эозинофилов 105
3.4. Изучение взаимного влияния церулоплазмина и белков лейкоцитов на их ферментативные свойства 108
3.4.1. Влияние серпроцидинов и пероксидазы эозинофилов на ферментативные свойства церулоплазмина 109
3.4.2. Изучение механизма ингибирования церулоплазмином миелопероксидазы, пероксидазы эозинофилов и 5 -липоксигеназы 110
3.4.3. Влияние церулоплазмина на активность серпроцидинов 127
3.4.4. Влияние апо-лактоферрина на деструкцию церулоплазмина индуцированную пероксидом водорода 130
3.5. Изучение протеолитической деградации церулоплазмина in vivo и in vitro 140
3.5.1. Протеолитическая деградация церулоплазмина в биологических жидкостях при воспалении 142
3.5.2. Идентификация протеиназ, деградирующих препараты церулоплазмина 144
3.6. Многокомпонентные комплексы церулоплазмина 152
3.6.1. Свойства комплексов церулоплазмина, миелопероксидазы и апоВ-100-содержащих липопротеинов 153
3.6.2. Проатерогенное действие миелопероксидазы при связывании с липопротеинами 165
3.6.2.1. Сродство миелопероксидазы к модифицированным липопротеинам 165
3.6.2.2. Проатерогенные свойства модифицированных липопротеинов 166
3.7. Антиоксидантные свойства ЦП, модифицированного окислителями 172
4. Обсуждение результатов 177
5. Выводы 203
6. Список сокращений 204
7. Список литературы
