Введение
1.1.. Структурно-функциональная характеристика хромосом и гетерохроматина 19
1 .1.2. Характеристика генома птиц 26
1.1.3. Нарушения структуры и функции хромосом 29
1.1.4. Использование методов трансгеноза для изучения структурно-функциональных характеристик хромосом 33
1.2. Линейная дифференцированность хромосом 36 1.2.1. Дифференциальная окраска хромосом 36 1.2.2,Организация генома и линейная дифференцированность хромосом 39
1.3. Репродукция хромосом 41 1.3.1 .Молекулярные аспекты репликации ДНК 41 1.3.2.Клеточный цикл 45 1.3.3 .Меж- и внутрихромосомная асинхронпость синтеза ДНК 49
1.4. Трансгсноз 54
1.4.1. Методы генетической модификации генома млекопитающих 54
1.4.2. Введение рекомбинантных плазмид в ядро оплодотворенной яйцеклетки 58
1.4.3. Эффективность трансгеноза у лабораторных и сельскохозяйственных животных 59
1.4.4. Молекулярные механизмы трансгеноза 63
1.4.5. Экспрессия генных конструкций 65
1.4.6. Выведение линий трансгенных животных 71
1.4.7. Особенности роста трансгенных животных 72
1.4.8. Активация эмбрионального генома 75
1.4.9. Перспективы использования трансгенных животных 78
1.5. Заключение к обзору литературы 81
ГЛАВА 2. Материал и методы 86
2.1. Материал исследования 86
2.2. Приготовление препаратов митотических хромосом 87
2,2.1 . Получение препаратов митотических хромосом из культуры эмбриональных фибробластов кур 87
2.2.2. Приготовление препаратов хромосом из клеток костного мозга 88
2.2.3. Культивирование лейкоцитов периферической крови и приготовление препаратов хромосом 89
2.3 Метод авторадиографии 90
2.3.1. Применение авторадиографии для исследования репродукции хромосом. 90
2.3.2. Анализ радиоавтографов 91
2.3.3. Авторадиографический анализ зигот кроликов и получение ультратонких срезов 92
2.4. Методы, выявляющие линейную дифференцированность хромосом 93
2.4.1. G-окраска хромосом кур и свиней 94
2.4.2. RBA-окраска хромосом кролика 94
2.5. Денситометрия 95
2.6. Морфометричсскии анализ и статистическая обработка материала 96
2.7. Кариотипирование хромосом кроликов и свиней 97
2.8. Получение вазектомированных кроликов 97
2.9. Получение зародышей кролика на стадии двух пронуклеусов 98
2.10. Подготовка доноров и реципиентов свиней 100
2.11. Метод микроинъекции генов в пронуклеусы ЗИГОТ 101
2.12. Трансплантация зародышей 102
2.13. Получение эмбрионов коров in vitro 103
2.13.1. Созревание ооцитов in vitro 103
2.13.2. Оплодотворение ооцитов коров in vitro и получение зигот 104
2.13.3. Культивирование in vitro эмбрионов коров 104
2.14. Методы, используемые при анализе экспрессии
репортерных генов 105
2.14.1 .Экспрессия GFP-гена 105
2.14.2. Экспрессия LacZ гена 105
2.15. Скрининг трансгенных животных 106
2.16. Генетические конструкции, использованные для микроинъекций в ранние эмбрионы 107
ГЛАВА 3. Результаты исследований 115
3.1. Морфометрический анализ макрохромосом кур 115
3.1.1. Размеры и морфология макрохромосом кур 115
3.1.2. Аберрации хромосом у эмбрионов кур 118
3.1.3. Влияние криоконсервации и сроков хранения семени на частоту и спектр хромосомных аберраций у кур 120
3.2. Линейная дифференцированность хромосом кур 125
3.2.1. Характеристика G-полос в макрохромосомах кур 125
3.2.2. Картирование G-полос первой пары аутосом домашних кур 128
3.3. Репродукция хромосом кур 132
3.3.1. Определение параметров G2- и S- периодов 132
3.3.2. Включение 3Н-тимидина в макро- и микрохромосомы цыплят 136 3.3.2.1.Репродукция хромосом кур в культуре эмбриональных фибробластов 136
3.3.3. Межхромосомная асинхронность синтеза ДНК 138
3.3.3.1. Межхромосомная асинхронность репликации ДНК в эмбриональных фибробластах кур 139
3.3.3.2. Межхромосомная асинхронность репликации ДНК в клетках костного мозга цыплят 144
3.3.4. Внутрихромосомиая асинхронность синтеза ДНК 153
3.3.4.1. Внутрихромосомиая асинхронность репликации ДНК в начале S-периода 153
3.3.4.2. Внутрихромосомиая асинхронность синтеза ДНК в конце S-периода 158
3.3.5. Взаимосвязь линейной структуры хромосом с внутрихромосомной асинхронностью репликации ДНК на примере 1-й аутосомы кур 164
3.4. Характеристика репликационной активности генома кролика методом RBA-маркирования 165
3.4.1.Идентификация хромосом кролика и кариотипирование 165
3.4.2. Характеристика репликационной активности генома кролика во второй половине S-периода 170
3.4.3. Сравнительная характеристика хромосом разных уровней конденсации 173
3.5. Пер вый раунд репликации ДНК в пронуклеусах кроликов 176
3.6. Перенос генов соматотропнои оси в зиготы кроликов 183
3.6.1. Получение ранних эмбрионов на стадии зиготы с оценкой их качества 183
3.6.2. Влияние процесса микроинъекции и величины микроигл на выживаемость эмбрионов 187
3.6.3. Влияние различных манипуляций, включая трансплантацию, на жизнеспособность зародышей до момента рождения 191 3.6.4.Анализ интеграции генетических конструкцций
МТ-1/ bGH и MT-1/hGRF в геном кроликов 198
3.6.5. Фенотипические показатели трансгенных кроликов с перенесенными генами hGRF и bGH 207
3.6.6. Характер наследования трансгенов hGRF и bGH и фенотипический анализ 211
3.6.7. Изучение стабильности генома кроликов, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали генную конструкцию MT-1/hGRF. 220
3.7. Введение гена рилизинг фактора гормона роста человека в оплодотворенные яйцеклетки свиней с последующим генетическим анализом 224
3.7.1. Получение ранних эмбрионов свиней и оценка их качества 224
3.7.2 Визуализация пронуклеусов и микроинъекция генной конструкции hGRF в зиготы свиней 228
3.7.3. Гибридизационный анализ интеграции гена hGRF в геном свиней 231
3.7.4. Фенотипические показатели трансгенных свиней 238
3.7.5. Цитогенетический анализ и изучение уровня стабильности генома свиней, полученных из эмбрионов, в которые микроинъецировали ген hGRF 240
3.7. Экспрессия репортсрных генов у доимплантационпых зародышей сельскохозяйственных животных 246
3.7.1. Экспрессия генов Lac Z у ранних эмбрионов кроликов 246
3.7.2. Экспрессия GFP гена у эмбрионов коров, полученных in vitro 253
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов
4.1. Организация хромосом птиц 259
4.2. Линейная дифференцированность и функциональная активность хромосом 261
4.3. Репликация ДНК в хромосомах эукариот 267
4.4. Трансгеноз сельскохозяйственных животных 274
Заключение 280
Выводы 283
Практическая значимость работы и реализация результатов 287
Список литературы
