Введение
1 Обзор литературы
1. Идентификация фактора PEDF в различных типах клеток 9
1.1. Идентификация PEDF в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека 9
1.2. Идентификация PEDF (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии PKDF от возраста клеточной культуры 12
1.3. Идентификация PEDF мыши (каспина - коллаген-связывающего серпина) 15
2. Особенности структуры PEDF и кодирующего его гена 16
2.1. Установление первичной структуры PEDF человека и его кДНК 16
2.2. Принадлежность PEDF к семейству нсингибиторных серпинов 18
2.3. Наличие в PEDF связи, высокочувствительной к действию сериновых протеиназ 20
2.4. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в молекуле PEDF. Кристаллическая структура PEDF 22
2.5. Строение и свойства гена^е^человека 25
2.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора PEDF 26
2.7. Рекомбинантный PEDF 28
3. Дифференцирующее действие PEDF и его влияние на метаболизм 29
3.1. Дифференцирующее действие PEDF на эмбриональные ткани. Влияние PEDF на метаболизм глиальных клеток 30
3.2. Дифференцирующее действие PEDF на опухолевые клетки 32
3.3. Влияние PEDF на накопление меланина и активность тирозиназы в клетках пигментного эпителия сетчатки глаза 33
4. Нейропротекторное действие PEDF 34
4.1. Протекторное действие PEDF на нейроны сетчатки глаза 35
4.2. Протекторное действие PEDF на гранулярные клетки мозжечка крыс 36
4.3. Протекторное действие PEDF на нейроны гиппокампа 38
4.4. Протекторное действие PEDF на двигательные нейроны спинного мозга 39
5. Антиангиогенное действие PEDF 40
5.1. Корреляция уровня PEDF и VEGF с ангиогенсзом в сетчатке. Влияние содержания кислорода в окружающей среде на экспрессию PEDF 41
5.2. Изменения уровня PEDF при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом 43
5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия PEDF 46
6. Взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами PEDF.
2 Результаты и обсуждение 53
1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов HLDF и PEDF, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки HL-60 и эктодерму эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы 54
1.1. Структурная гомология фрагментов молекул факторов HLDF и PEDF. Сравнительное изучение дифференцирующего действия факторов HLDF и PEDF на клетки линии HL-60 54
1.2. Сравнительное изучение индукционного действия факторов HLDF и PEDF, а также пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на эктодерму эмбрионов X. laevis 60
2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии HL-60 при индуцированной химической гипоксии 63
2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка 64
2.2. Влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на выживаемость клеток линии HL-60 при индуцируемой химической гипоксии 71
3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на клетки линии HL-60 73
3.1. Определение характера взаимодействия пептидов с клетками. Влияние пептидов на подвижность липидов в мембранных системах 73
3.2. Влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на активность аденилатциклазы в клетках линии HL-60 и выделенных клеточных мембранах 75
3.3. Влияние пептидов HLDF-6 и PEDF-6 на активность фосфатидилинозитол-слецифической фосфолипазы С 80
4. Компьютерное моделирование пространственной структуры PEDF. Регуляторная роль протеолиза связи L- Т в молекуле PEDF 84
5. Роль фактора PEDF в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Xenopus laevis 90
3 Экспериментальная часть 95
1. Материалы 96
1.1. Реактивы 96
1.2. Сорбенты 97
1.3. Протеолитические ферменты 98
1.4. Факторы дифференцировки, антитела, клеточные линии 98
1.5. Буферные растворы 98
1.6. Растворы для индукции дифференцировки эмбрионов Xenopus laevis и гистологической обработки тканей 99
2. Методы 101
2.1. Культивирование клеток линии HL-60 101
2.2. Определение дифференцирующей активности 101
2.3. Исчерпывающий гидролиз белков смесью трипсина и а-химотрипсина 102
2.4. Синтез пептидов 102
2.5. Дополнительная хроматографическая очистка синтезированных пептидов 102
2.6. Индукция дифференцировки эктодермы эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструл ы 103
2.7. Гистологическая обработка дифференцированной эктодермы Xenopus laevis 104
2.8. Содержание экспериментальных животных 104
2.9. Изучение влияния пептидов на поведенческие реакции крыс, зависимые от функций червя мозжечка 104
2.10. Определение количества гиперхромных клеток Пуркиньс червя мозжечка крьіс 106
2.11. Определение количества жизнеспособных клеток HL-60 методом МТТ-теста 107
2.12. Радиолигандный анализ 107
2.13. Получение липосом, содержащих флуоресцентный зонд 108
2.14. Изучение влияния пептидов на анизотропию поляризации флуоресценции зондавлипосомах 108
2.15. Хроническая морфинизация клеток HL-60 109
2.16. Выделение и солюбилшация мембран клеток HL-60 109
2.17. Изучение влияния пептидов на активность аденилатциклазы в клетках HL-60 и препарате выделенных мембран клеток HL-60 110
2.18. Определение количества цАМФ в пробах 111
2.19. Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60 111
2.20. Выделение стекловидного тела глаза быка 112
2.21. Измерение концентрации белка методом Бредфорд 112
2.22. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей 113
2.23. SDS-злектрофорез белков в поли акри ламидном геле 113
2.24. Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы PEDF ИЗ
2.25. Статистическая обработка экспериментальных результатов 114
Выводы 116
