Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Общие сведения о структуре и свойствах тропомиозина 13
Распространение тропомиозина и многообразие его функций. Новая номенклатура изоформ тропомиозина . 13
Структура молекулы Tpm и принципы ее формирования. 16
Актин – основной партнер тропомиозина. Структура комплекса Tpm с актином. 20
Функциональные свойства тропомиозина: участие в регуляции мышечного сокращения 24
1.2. Центральная часть молекулы тропомиозина и ее особенности 25
Кластеры дестабилизации в центральной части Tpm или что в ней особенного . 25
Механизм дестабилизации центральной части Tpm и зачем это нужно. 27
1.3. Наследственные заболевания, ассоциированные с точечными мутациями в генах тропомиозина 28
Морфологические особенности и многообразие заболеваний, ассоциированных с мутациями в генах Tpm. 28
Гены Tpm, в которых обнаружены кардиомиопатические и миопатические мутации. Неоднородность распределения мутаций. 32
Предполагаемые механизмы развития наследственных заболеваний мышц, ассоциированных с мутациями в генах тропомиозина. 34
Некоторые конкретные аминокислотные замены в молекуле Tpm 39
1.4. Гетеродимеры тропомиозина – одна из важных форм его существования 42
Виды существующих в мышцах гетеродимеров Tpm и их распределение. 42
Методы получения гетеродимеров Tpm in vitro и подходы к их изучению.
Структурно-функциональные особенности -гетеродимеров Tpm. 43
Гетеродимеры и гомодимеры Tpm с мутациями лишь в одной из двух цепей. Почему
это так важно изучать. 43
2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Получение препаратов белков 45
Сайт-направленный мутагенез. 45
Экспрессия рекомбинантного тропомиозина в клетках E. сoli. 48
Выделение и очистка Tpm методом ионообменной хроматографии. 49
Выделение и очистка Tpm методом металло-аффинной хроматографии. 50
Формирование гетеродимеров Tpm и его гомодимеров с мутацией в одной из двух цепей. 50
Получение других белков, используемых в работе. 51
2.2. Методы, использованные для анализа структуры молекулы тропомиозина 52
Спектроскопия кругового дихроизма (КД). 52
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 52
Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пиренил-меченого Tpm 54
2.3. Методы исследования функциональных свойств тропомиозина 55
Исследование взаимодействия Tpm с F-актином методом соосаждения 55
Определение температурных зависимостей диссоциации комплексов Tpm с F актином по изменениям светорассеяния. 55
Определение АТФазной активности S1 в присутствии реконструированных тонких
филаментов. 56
Измерение вязкости растворов Tpm. 57
Эксперименты в искусственной подвижной системе (ИПС, in vitro motility assay). 57
Измерения, выполненные в оптической ловушке. 59
2.4. Другие аналитические методы 59
Определение концентрации белков спектрофотометрическим методом SDS-гель электрофорез 60
3. Результаты и их обсуждение 61
3.1. Исследования центральной части молекулы Tpm. 61
Структурные исследования. 62
Функциональные исследования 77
3.2. Структурно-функциональные исследования рекомбинантных препаратов Tpm с аминокислотными заменами, соответствующими кардиомиопатическим и миопатическим мутациям в генах Tpm. 93
Исследования препаратов Tpm с аминокислотными заменами, соответствующими кардиомиопатическим мутациям в генах Tpm. 93
Исследования препаратов Tpm с аминокислотными заменами, соответствующими миопатическим мутациям в генах Tpm. 102
3.3. Исследования гетеродимеров и гомодимеров Tpm с аминокислотными заменами в одной из двух цепей молекулы . 107
Структурно-функциональные исследования -гетеродимеров Tpm с аминокислотными заменами в -цепи и -гомодимеров Tpm с заменами лишь в одной
из двух -цепей. 108
Структурно функциональные исследования afi-гетеродимеров Тртс
аминокислотными заменами в fi-uenu. 114
Заключение 118
Список используемой литературы
