Введение
1. Актин 19
1.1. Структура молекулы актина и стадии образования полимера 19
1.2. Построение различных сетей актиновых филаментов 23
1.3. Механические свойства актинового цитоскелета 26
2. Актин-связывающие белки, образующие различные актиновые структуры 27
3. Основные сигнальные пути, регулирующие построение актиновых структур 31
3.1. Семейство Rho ГТФаз 31
3.2. Rho ГТФазы и актиновый цитоскелет 32
3.3. ERK-MAPK каскад и актиновый цитоскелет 36
3.4. Фосфатазы, выполняющие функцию опухолевых супрессоров 37
4. Контакты фибробластов с внеклеточным матриксом 38
5. Компоненты внеклеточного матрикса 42
6. Межклеточные контакты 46
7. Изоформы актина 49
8. Регуляция экспрессии изоформ актина 52
9. Функции актиновых изоформ 56
9.1 Локализация и распределение изоформ актина 57
9.2. Саркомерные актины 57
9.3. Гладкомышечные актины (SMA) 58
9.4. Цитоплазматические актины (CYAs) 60
10. Реорганизация актина при неопластической трансформации 62
11. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) 63
12. МАРК в опухолевой прогрессии з
12.1. Сигнальные каскады МАРК 65
12.2 Роль ERK1/2 сигнального пути при ЭМП III типа 67
12.3 Окислительный стресс, МАРК сигнальные пути и ЭМП 69
13. заключение 72
Основные материалы и методы исследования 73
1. Культивирование клеток и реагенты 73
2. Иммунофлуоресценция. Световая микроскопия 75
3. Фазово-контрастная и интерференционно-отражательная микроскопия 76
4. Морфометрия клеток 76
5. Морфометрия фокальных контактов (ФК) 77
6. Иммунофлуоресценция и Лазерная Сканирующая Конфокальная микроскопия 78
7. Трансфекция малыми интерферирующими РНК (siRNA) 79
8. Трансфекция EGFP- конструкциями и ретровирусными конструкциями онкогенов RAS 79
9. Морфометрия клеток в экспериментах с siRNA 79
10. Прижизненная микроскопия после siRNA трансфекции 80
11. Характеристика антител к изоформам актина 81
12. Электрофорез белков и иммуноблоттинг 81
13. Статистический анализ 82
14. Сравнительное иммуноморфологическое исследование нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека 82
15. Сравнительное иммуноморфологическое исследование нормальной и опухолевой ткани шейки матки человека 84
Результаты и обсуждение 85
Часть 1. Исследование цитоскелетных характеристик и организации адгезионных структур a-SMA - позитивных и a-SMA - негативных культивируемых крысиных фибробластов различного органного происхождения 85
1.1. Морфометрия a-SMA - позитивных и a-SMA - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождения 86
1.2. Цитоскелетные структуры и фокальные контакты (ФК) у a-SMA - позитивных и х-SMA - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождения... 88 1.3. Организация клеточного FN у a-SMA - позитивных и a-SMA - негативных клеток в популяциях фибробластов различного происхождении 91
1.4. Прижизненное изучение влияния экспрессии a-SMA на псевдоподиальную активность фибробластов 92
1.5. Обсуждение. Сравнительные цитоскелетные характеристики и организация адгезионных структур у a-SMA-позитивных и a-SMA-негативных клеток в культурах крысиных фибробластов различного органного происхождения 94
Часть 2. Динамическая молекулярная организация контактов клетки с внеклеточным матриксом при модуляциях экспрессии a-SMA . 96
2.1. Роль a-SMA изоформы в эволюции ФК 96
2.1.1. Анализ разнообразия и характеристика категорий ФК 96
2.1.2. Биохимическая характеристика ФК-ассоциированных белков 101
2.1.3. Действие рекомбинантного фрагмента клеточного фибронектина rED-A и блокирующих антител на организацию FN сети и созревание ФК 103
2.1.4. rED-A связывается с полимеризованным FN 103
2.1.5. Влияние актомиозиновой сократимости на структуру стресс-фибрилл и ФК 108
2.1.6. Суперсозревание ФК зависит от повышенной сократимости, связанной с экспрессией -SMA 113
2.1.7. Действие ингибиторов МЕК1 и р38 на полимеризацию FN и экспрессию a-SMA 115
2.1.8. Индукция миофибробластной дифференцировки с помощью митохондриально - направленных антиоксидантов 117
2. 2. ОбсуждениЕ 119
2.2.1. Функция a-SMA связана с модуляцией ФК при дифференцировке фибробластов в миофибробласты 119
2.2.2. Формирование фибрилл FN под действием TGFp 121
2.2.3. Роль р38 в полимеризации FN и модуляции миофибробластов 122
2.2.4. Равновесие натяжения, определяемого актомиозиновым цитоскелетом, и устойчивостью внеклеточного матрикса в суперзрелых ФК 122
Часть 3. Исследование организации и распределения цитоплазматических актинов в немышечных клетках .124
3.1. Характеристика mAbs к р- и y-CYA 124 3.2. Изучение внутриклеточной локализации р- и y-CYA в фибробластах и эпителиальных клетках при распластывании и в стабильном состоянии 126
3.3. Организация цитоплазматических актинов при миграции клеток 132
3.4. Соотношение между сегрегацией актиновых изоформ и актомиозиновой сократимостью 135
3.5. Разная чувствительность цитоплазматических актинов к ингибиторам малых ГТФаз и агентам, меняющим полимеризацию актин 137
3.6. Действие РНК-интерференции р- и y-CYA на морфологию и подвижность...139
3.6.1. РНК интерференция р- и y-CYA в подкожных фибробластах 139
3.6.2. РНК интерференция p-CYA и y-CYA в эпителиальных клетках 145
3.7. Индивидуальные роли p-CYA и y-CYA в регуляции эпителиальных апикальных межклеточных контактов 147
3.8. Изучение реорганизации актинового цитоскелета при неопластической трансформации в различных экспериментальных системах 149
3.8.1. Реорганизация актинового цитоскелета культивируемых фибробластов под действием опухолевого промотора 149
3.8.2. Изменения актинового цитоскелета культивируемых фибробластов, связанные с неопластической трансформацией онкогеном N-RAS 152
3.8.3. Изменения актинового цитоскелета культивируемых фибробластов, связанные с неопластической трансформацией вирусом SV40 153
3.8.4. Изменения актинового цитоскелета культивируемых эпителиальных клеток, индуцируемые скеттер-фактором HGF/SF 154
3.8.5. Изменения актинового цитоскелета культивируемых эпителиальных клеток, связанные с неопластической трансформацией онкогеном N-RAS 157
3.8.6. Организация актинового цитоскелета в культивируемых опухолевых кератиноцитах 157
3.8.7. Фенотипическая нормализация неопластически трансформированных клеток с помощью митохондриально - направленных антиоксидантов: реорганизация актина 161
3.9. Обсуждение. Изучение внутриклеточной локализации и функций р- и y-CYA
в фибробластах и эпителиальных клетках в стационарном состоянии и при
реорганизациях актинового цитоскелета 166
Часть 4. Исследование реорганизации изоформ актина в нормальных и опухолевых тканях человека 173 4.1. Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и
опухолевой ткани молочной железы человека .173
4.1.1. Исследование распределения изоформ актина в эпителиальных структурах нормальной ткани молочной железы 173
4.1.2. Исследование распределения изоформ актина в доброкачественных опухолях и диспластических структурах молочной железы 176
4.1.3. Исследование распределения изоформ актина в злокачественных опухолях люминального типа 178
4.1.4. Актины как цитоскелетные маркеры в диагностике базальноподобного рака молочной железы (РМЖ) человека 179
4.2. Выявление цитоплазматических изоформ актина в клетках нормального экзоцервикса и инвазивного рака шейки матки 185
4.3. Обсуждение 187
4.3.1. Распределение изоформ актина в клетках нормальной, диспластической и опухолевой ткани люминального типа молочной железы человека .187
4.3.2. Иммуногистохимические методы в диагностике морфологических и молекулярно - биологических типов РМЖ .188
4.3.3. Реорганизация изоформ актина и адгезионных контактов при эпителиально-мезенхимальном переходе в клетках цервикальных карцином 191
Заключение 194
Выводы 200 список статей, опубликованных по теме диссертации 201
Список сокращений 204
Список литературы
