Введение
1. Введение 8
2. Обзор литературы 13
Регуляторные элементы генома 13
2.1. Инсуляторы 13
2.1.1. Функции инсуляторов 14
2.1.2. Белки, обеспечивающие действие инсуляторов 20
2.1.3. Механизмы блокирования энхансеров
2.1.3.1. Модель ловушки (promoter decoy) 23
2.1.3.2. Модель отслеживания (tracking)
2.1.4. Нейтрализация эффекта положения 26
2.1.5. Инсуляторы и S/MAR-элементы 27
2.1.6. Регуляция функционирования инсуляторов 29
2.1.7. Локус-контролирующие последовательности 31
2.2. Белок CTCF и его роль в крупномасштабной регуляции активности генома позвоночных 32
2.2.1. CTCF как многофункциональный регулятор 33
2.2.1.1. CTCF и гены, ассоциированные с раком 33
2.2.1.2. CTCF и развитие: регулятор основных регуляторов? 34
2.2.2. CTCF и функционирование генома 36
2.2.2.1. Геномное распределение сайтов связывания CTCF 36
2.2.2.2. CTCF опосредует взаимодействие между регуляторными сайтами на больших расстояниях
2.2.3. Взаимодействие CTCF с другими белками 38
2.2.3.1. CTCF и когезиновый комплекс 40
2.2.4. CTCF и повторяющиеся элементы генома 41
2.2.5. Регуляция гена CTCF 41
2.2.5.1. Возможные механизмы регуляторной активности CTCF 42
2.3. Ретроэлементы 44
2.3.1. Краткая история исследования ретровирусов и ретроэлементов 44
2.3.2. Жизненный цикл и строение ретровирусов, синтез LTR 45
2.3.3. Возникновение, структура и классификация ретроэлементов 47
2.3.4. Структура эндогенных ретровирусов 52
2.3.5. Семейство HERV-K(HML-2) 53
2.3.6. Функциональные элементы в составе LTR 54
2.3.7. Биологическая ролъ LTR 2.3.7.1. Экспрессия вирусных генов 59
2.3.7.2. Влияние LTR на экспрессию клеточных генов 60
2.3.7.3. Защита от повторного заражения 62
2.3.7.4. Придание пластичности геному 62
2.3.8.Белковые факторы транскрипции, способные связываться с LTR 63
3. Материалы и методы 64
3.1. Материалы 64
3.2. Методы 3.2.1. Стандартные методики 67
3.2.2. Культивирование клеток 67
3.2.3. Трансфекция клеток 68
3.2.4. Трансфекция клеток электропорацией 68
3.2.5. Позитивно-негативная селекция последовательностей потенциальных инсуляторов 69
3.2.6. Получение вирусных частиц и инфицирование клеток 69
3.2.7. Определение титра вирусных частиц 70
3.2.8. Селекция клеток на среде с генетицином G 418 70
3.2.9. Получение библиотеки фрагментов ДНК локуса FXYD5-COX7A хромосомы 19 человека 3.2.10. Радиоактивное мечение праймеров 71
3.2.11. Очистка меченой ДНК 71
3.2.12. Определение активности люциферазы 72
3.2.13. Фиксация и окрашивание клеток с помощью Coomasie Blue 73
3.2.14. Картирование последовательностей на геноме 73
3.2.15. Метод двумерного EMSA 73
3.2.16. Иммунопреципитация хроматина 74
3.2.17. Двумерный электрофорез с ультрафиолетовой сшивкой 74
3.2.18 Приготовление ДНК-аффинного носителя 75
3.2.19. Фракционирование ядерного экстракта на ДНК-аффинной колонке 77
3.2.20. Фракционирование ядерного экстракта методом аффинной элюции 77
3.2.21. Обработка гелей, гидролиз трипсином и экстракция пептидов 78
3.2.22. Анализ триптических пептидов при помощи масс-спектрометрии 79
4. Результаты и обсуждение 80
4.1. Стратегия идентификации энхансер-подобных элементов в протяженных областях сложных геномов 80
4.1.2. Экспериментальная идентификация и картирование энхансер-подобных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека 80
4.1.3. Создание векторных конструкций для селекции энхансер-подобных элементов 81
4.1.4. Клонирование и селекция энхансер-подобных элементов 82
4.1.5 Анализ отобранных потенциальных энхансерных фрагментов. 89
4.1.6.Способность отобранных фрагментов связываться с клеточными белками
4.1.7. Способность отобранных фрагментов активировать минимальный промотор с репортерным геном 93
4.1.8. Анализ расположения потенциальных энхансеров в геноме. Построение карт ы расположения энхансеров 94
4.1 .Функциональный анализ активности потенциального энхансера "U2AF1L4" 97
4.2. Стратегия экспериментального поиска инсуляторов в протяженных областях сложных геномов 100
4.2.1. Система для экспериментального поиска инсуляторов 101
4.2.2.А нализ расположения инсуляторов в геноме 105
4.2.3 Функциональный анализ инсуляторов 108
4.3. Энхансер-блокирующая активность CTCF-связывающих последовательностей 112
4.4. Идентификация и картирование CTCF-связывающих последовательностей в глобиновом локусе птиц 119 4.5.Анализ функциональной архитектуры LTR семейства HERV-K(HML-2) и его взаимодействий срегуляторными компонентами клетки 126
4.5.1.Характеристика LTRHERV-K 126
4.5.2. Промоторная активност ъ LTR 130
4.5.3.Негативный регуляторный элемент (НРЭ) 135
4.5.4.Энхансерная активность LTR 136
4.5 5.Клеточные белки, специфически связывающиеся с LTR HERV-K 138
4.5.6. Связывание белков другими участками LTR 147
4.5.7.Связывание белков с негативнымрегуляторным элементом (NRE) 149
4.5.8.Идентификация белков, потенциально ответственных за энхансерную активность LTRHERV-K 151
4.5.9.Выделение и идентификация белков ERLBF1, 2 и 3, специфически связывающихся с LTRHERV-K 153
5. Выводы 166
6. Список цитированной литературы
