1. Введение .................................................................................................... 6
1.1. Актуальность темы исследования ........................................................... 6
1.2. Цель работы и поставленные задачи ....................................................... 7
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы ........................... 8
1.4. Положения, выносимые на защиту .......................................................... 9
1.5. Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в
диссертации ....................................................................................................... 9
1.6. Апробация работы ................................................................................... 10
2. Обзор литературы ................................................................................. 13
2.1. B-клеточное звено иммунной системы и современные методы изучения
репертуаров иммуноглобулинов ...................................................................... 13
2.1.1. Разнообразие B-клеточных субпопуляций .................................... 13
2.1.2. Этапы развития B-клеток. От клеток-предшественников до зрелых
продуцентов антител. ..................................................................................... 14
2.1.3. Роль B-клеток в иммунном ответе ................................................. 19
2.1.4. Современные подходы изучения репертуаров
иммуноглобулинов ..................................................................................... 23
2.1.4.1. Комбинаторные подходы изучения репертуаров
иммуноглобулинов ............................................................................... 24
2.1.4.2. Комбинаторные фаговые библиотеки ........................................ 24
2.1.4.3. Комбинаторные библиотеки антител ......................................... 25
2.1.4.4. PhIP-Seq – иммунопреципитация фагов с дальнейшим
секвенированием ............................................................................................ 26
2.1.4.5. PLATO ........................................................................................... 28
2.1.4.6. Микрофлюидные подходы для изучения репертуаров
единичных клеток ........................................................................................... 29
2.1.4.7. Технология правильного сочетания вариабельных фрагментов
тяжёлых и лёгких цепей иммуноглобулинов .............................................. 30
2.1.4.8. Секвенирование репертуаров единичных B-клеток .................. 31
2.2. Роль B-клеток в развитии рассеянного склероза ................................. 32
2.2.1. Патологические аутоантитела при рассеянном склерозе ............. 37
2.2.2. Презентация антигена и активация Т-клеточного звена B-клетками
при рассеянном склерозе ............................................................................... 40
2.2.3. Дисбаланс цитокинов, продуцируемых B-клетками при РС. ...... 41
2.2.4. Роль регуляторных B-клеток в развитии рассеянного склероза . 43
3. Материалы и методы ........................................................................... 46
3.1. Пациенты и здоровые доноры. .............................................................. 46
3.2. Методы работы с нуклеиновыми кислотами ....................................... 47
3.2.1. Полимеразная цепная реакция ........................................................ 47
3.2.2. Эмульсионная ПЦР .......................................................................... 47
3.2.3. Разрушение эмульсии ...................................................................... 48
3.2.4. Олигонуклеотидные реагенты ........................................................ 49
3.2.5. Подготовка библиотеки NGS и секвенирование библиотеки ...... 49
3.2.6. Рестрикция ........................................................................................ 50
3.2.7. Лигирование ..................................................................................... 50
3.2.8. Выделение плазмидной ДНК .......................................................... 50
3.2.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле ............................................. 51
3.2.10. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле .......................... 51
3.2.11. Очистка ДНК из агарозного геля ................................................ 51
3.2.12. Очистка ДНК на магнитных частицах ........................................ 51
3.3. Методы работы с бактериями E.coli ..................................................... 52
3.3.1. Получение электрокомпетентных клеток ...................................... 52
3.3.2. Трансформация E.coli методом электропорации .......................... 52
3.3.3. Ночная культура ............................................................................... 53
3.3.4. Бактериальная экспрессия белков .................................................. 53
3.3.5. Выделение белков из растворимой фракции ................................. 53
3.4. Методы работы с бактериофагами ........................................................ 54
3.4.1. Экспрессия рекомбинантных бактериофагов ................................ 54
3.4.2. Очистка фаговых частиц ................................................................. 54
3.5. Методы работы с эукариотическими линиями клеток ........................ 55
3.5.1. Культивирование клеточных линий ............................................... 55
3.5.2. Проточная цитометрия антиген-специфичных клеток, с окрашиванием
бактериофагами .............................................................................................. 56
3.5.3. Экспрессия полноразмерных антител человека ............................ 56
3.5.4. Лентивирусный дисплей на клетках Jurkat .................................... 57
3.6. Методы работы с B-клетками человека ................................................ 58
3.6.1. Выделение В-клеток из периферической крови ........................... 59
3.6.2. Окрашивание B-клеток для определения различных
субпопуляций .................................................................................................. 59
3.6.3. Подготовка библиотек для секвенирования последовательностей
иммуноглобулинов (RT-PCR) ....................................................................... 60
3.6.4. Широкомасштабное секвенирование вариабельных фрагментов VH,
Vκ и Vλ иммуноглобулинов .......................................................................... 61
3.6.5. Анализ данных широкомасштабного секвенирования ................. 61
3.6.6. Анализ секреции IL-10 В-клетками ................................................ 62
3.7. Методы работы с белками ...................................................................... 63
3.7.1. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле ........ 63
3.7.2. Иммуноферментный анализ ............................................................ 63
3.7.3. Металл-аффинная хроматография ................................................. 64
3.7.4. Аффинная хроматография Protein G .............................................. 64
3.7.5. Гель-фильтрация .............................................................................. 64
3.8. Измерения констант связывания антител методом поверхностного
плазмонного резонанса ..................................................................................... 65
3.9. Статистический анализ ........................................................................... 65
4. Результаты и обсуждения .................................................................... 66
4.1. Поиск новых мишеней аутоиммунной агрессии при рассеянном
склерозе .............................................................................................................. 66
4.1.1. Создание ДНК-библиотек, кодирующих перекрывающиеся фрагменты
белков, ассоциированных с аутоиммунной агрессией ............................... 67
4.1.2. Создание фаг-дисплейной библиотеки перекрывающихся фрагментов
аутоантигенов на основе вектора fADL ....................................................... 75
4.1.3. Разработка платформы для высокопроизводительного скрининга
антиген-специфичных иммуноглобулинов на основе модельной библиотеки
вирусных иммуногенов .................................................................................. 79
4.1.4. Идентификация кандидатных маркеров РС на основе данных
PhIP-Seq ........................................................................................................... 88
4.1.5. Исследование реактивности сывороточных антител у пациентов с РС к
антигенам ВЭБ, классическим миелиновым антигенам и пептидам, отобранным
по результатам PhIP-Seq ................................................................................ 90
4.1.6. Изучение кросс-реактивности антиген-специфичных аутоантител,
отобранных на кандидатные маркеры у пациентов с РС ........................... 94
4.1.7. Независимая валидация выявленных антигенов методом ИФА и их
значение в качестве клинических биомаркёров .......................................... 97
4.2. Анализ репертуаров иммуноглобулинов транзиентных B-регуляторных
клеток пациентов с рассеянным склерозом и здоровых доноров ............... 104
4.2.1. Характеризация субпопуляции транзиентных B-регуляторных
клеток .......................................................................................................... 104
4.2.2. Анализ репертуаров BCR транзиентных B-регуляторных
клеток ...................................................................................................... 107
4.2.3. Анализ частоты встречаемости генов зародышевой линии
VH, Vk, Vλ. ...................................................................................................... 111
4.2.4. Анализ зрелости субпопуляции транзиентных B-регуляторных клеток
у пациентов с РС и здоровых доноров ....................................................... 115
4.2.5. Повышение продукции IL-10 в субпопуляции
CD19+CD24highCD38high клеток .................................................................... 118
5. Выводы ................................................................................................. 121
6. Благодарности ..................................................................................... 122
7. Список сокращений ............................................................................ 123
8. Список цитированной литературы ................................................. 126
9. Приложения ......................................................................................... 144
Приложение 1. Таблица 1. Клинические характеристики пациентов с РС и
здоровых доноров, принявших участие в исследовании иммунного ответа на
потенциальные мишени аутоиммунитета. .................................................... 144
Приложение 2. Таблица 2. Клинические характеристики пациентов с РС,
боковым амиотрофическим склерозом, заболеванием спектра
оптиконевромиелита и здоровых доноров, принявших участие в независимом
исследовании иммунного ответа на потенциальные мишени
аутоиммунитета. .............................................................................................. 146
Приложение 3. Таблица 3. Клинические характеристики пациентов с РС и
здоровых доноров, принявших участие в исследовании B-клеточного репертуара
и CD27 фенотипическом анализе. .................................................................. 149
Приложение 4. Таблица 4. Клинические характеристики вакцинированных и
невакцинированных доноров для изучения функциональности фаговой
библиотеки RBD. ............................................................................................. 151
Приложение 5. Таблица 5. Список праймеров, использованных для
секвенирования индивидуальных репертуаров VH, Vκ и Vλ генов
иммуноглобулинов. ......................................................................................... 152
